🦠 Průkaz Listeria monocytogenes a Listeria spp.

Mikrobiologie PN-EN ISO 11290-1

Přehled

STAV (k 07.11.2026). PN-EN ISO 11290-1:2017-07 — katalogový list PKN bez poznámky o zrušení; zavádí EN ISO 11290-1:2017 a ISO 11290-1:2017 [IDT], nahrazuje PN-EN ISO 11290-1:1999 včetně změny A1:2005. Norma má v katalogu PKN dva katalogové listy téhož vydání: anglická verze vydaná 18-07-2017 (50 s.) a polská verze vydaná 07-01-2021 (42 s.) — přibližně tři a půl roku existovalo platné vydání v souboru PN pouze v angličtině. Datum vydání na polském katalogovém listu (07-01-2021) není datem zařazení normy do souboru. ISO 11290-1:2017 má v katalogu iTeh status „k revizi“. K vydání z roku 2017 vyšla novější změna ISO/EN: ISO 11290-1:2017/Amd 1:2026 (EN ISO 11290-1:2017/A1:2026), vydaná 15-07-2026, týkající se uchovávání vzorků před zkoušením a změny kontrolního kmene pro zkoušení vhodnosti půd — její převzetí do polských norem jsme ke dni odečtu nepotvrdili. Dostupný text je první vydání ISO 11290-1:2017 po změně (náhled do bodu 9.4.2) a text změny Amd 1:2026; popis vychází z tohoto vydání.

ROZSAH (kap. 1). Norma uvádí horizontální metodu průkazu L. monocytogenes a průkazu Listeria spp. (včetně L. monocytogenes). Používá se pro produkty určené k lidské spotřebě a ke krmení zvířat a pro vzorky prostředí odebrané v oblasti výroby potravin a manipulace s potravinami. Je možné, že některé nově popsané druhy Listeria touto metodou nebudou prokázány ani potvrzeny. Druhé vydání nahradilo vydání z roku 1999 (ISO 11290-1:1996); hlavní změny jsou mimo jiné primární pomnožení v polovičním Fraserově bujónu 25 h ± 1 h, sekundární pomnožení ve Fraserově bujónu 24 h ± 2 h, fakultativní mikroskopický obraz, fakultativní test CAMP a kataláza a zahrnutí průkazu Listeria spp. do rozsahu a názvu normy.

PRINCIP (kap. 4). Listeria se může vyskytovat v malém počtu, obvykle vedle mnohem početnějších jiných mikroorganismů, proto je nutné selektivní pomnožení; navíc je třeba prokázat oslabené buňky, což primární pomnožení se sníženou koncentrací inhibitorů zčásti umožňuje (přítomnost L. monocytogenes bývá maskována jinými druhy, zejména L. innocua nebo L. ivanovii). Zkouška má čtyři po sobě jdoucí etapy: primární pomnožení v polovičním Fraserově bujónu (poloviční koncentrace akriflavinu a kyseliny nalidixové), který je zároveň ředicím roztokem, inkubované při 30 °C; sekundární pomnožení v plném Fraserově bujónu inkubované při 37 °C; vyočkování na dvě selektivní pevné půdy — agar Listeria podle Ottavianiho a Agostiho (ALOA) a druhou selektivní půdu založenou na jiném substrátu nebo principu, kterou volí laboratoř; potvrzení presumptivních kolonií morfologickými a biochemickými zkouškami.

POSTUP (kap. 9, v rozsahu dostupného textu do bodu 9.4.2). Výchozí suspenze se obvykle připravuje z 25 g nebo 25 ml zkušebního podílu a 225 g nebo 225 ml polovičního Fraserova bujónu (desetinásobné ředění); norma je validována pro podíl do 25 g, menší lze zkoušet bez další validace při zachování stejného poměru. Primární pomnožení: poloviční Fraserův bujón se inkubuje při 30 °C po dobu 25 h ± 1 h (během něj se může objevit černé zbarvení; vzorek lze po inkubaci uchovat při 5 °C před převedením do Fraserova bujónu nejvýše 72 h). Sekundární pomnožení: 0,1 ml primární kultury se převede do 10 ml Fraserova bujónu a inkubuje při 37 °C po dobu 24 h ± 2 h. Vyočkování a izolace: z primární kultury (po 25 h) a ze sekundární kultury (po 24 h) se kličkou vyočkuje agar ALOA a druhá selektivní půda tak, aby se získaly dobře izolované kolonie; plotny ALOA se obrátí a inkubují při 37 °C celkem 48 h ± 2 h, a jsou-li po 24 h ± 2 h vidět presumptivní kolonie, lze inkubaci v této fázi ukončit; druhá půda se inkubuje podle výrobce. Poloviční Fraserův a Fraserův bujón lze uchovat při 5 °C před vyočkováním nejvýše 72 h a plotny po inkubaci — nejvýše 48 h před odečtem.

ODEČET NA ALOA (bod 9.4.2). Za presumptivní kolonie L. monocytogenes se považují modrozelené kolonie obklopené neprůhledným halo (typické kolonie); kolonie L. ivanovii jsou rovněž modrozelené s halo. Za presumptivní kolonie Listeria spp. se považují modrozelené kolonie s halo nebo bez něj. Některé kmeny L. monocytogenes vystavené stresu, zejména kyselému, mohou mít velmi slabé halo nebo žádné.

POTVRZENÍ (kap. 4.5, předmluva normy; schéma PIWet-PIB). Presumptivní kolonie se přeočkují na neselektivní půdu (například agar TSYEA) a potvrdí zkouškami: hemolýza, fermentace L-rhamnózy a D-xylózy, barvení podle Grama a také — fakultativně — test CAMP, test na katalázu a zkouška pohyblivosti. Mikroskopický obraz je fakultativní, umožňuje-li izolační půda odlišit patogenní Listeria od nepatogenních. Potvrzení rozhodne, zda je izolát L. monocytogenes, nebo jiná Listeria spp.

PŘEDPIS. Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 (konsolidované znění z 01.07.2026), příl. I kap. 1, kritéria bezpečnosti potravin pro L. monocytogenes: potraviny připravené k přímé spotřebě určené pro kojence a pro zvláštní lékařské účely (řádek 1.1) — „nepřítomnost v 25 g“, n = 10, c = 0, referenční metoda EN/ISO 11290-1; potraviny připravené k přímé spotřebě podporující růst L. monocytogenes (řádek 1.2) — 100 KTJ/g (EN/ISO 11290-2) nebo „nepřítomnost v 25 g“ (EN ISO 11290-1), podle toho, zda výrobce prokázal, že úroveň nepřekročí 100 KTJ/g během doby údržnosti; potraviny připravené k přímé spotřebě nepodporující růst (řádek 1.3) — 100 KTJ/g (EN/ISO 11290-2). Podle čl. 5 odst. 2 se vzorky z výrobních prostor a zařízení odebírají referenční metodou ISO 18593, je-li to nutné k ověření přítomnosti L. monocytogenes v podnicích vyrábějících potraviny připravené k přímé spotřebě. Alternativní metody jsou přípustné po validaci podle EN ISO 16140-2.

DRUHÉ ZDROJE. Schéma ve školicích materiálech PIWet-PIB (2019) má stejné etapy: navážka → poloviční Fraser 30 °C 24–26 h → Fraser 37 °C 24 ± 2 h → ALOA a druhá půda (například PALCAM) 37 °C → potvrzení (TSYEA, hemolýza, fermentace L-rhamnózy a D-xylózy, barvení podle Grama, CAMP, kataláza, pohyblivost — fakultativně). Příručka FDA (BAM, kap. 10) popisuje americkou variantu s jinými půdami: pomnožení v bujónu BLEB (pufrovaný pomnožovací bujón pro Listeria) při 30 °C, s přidáním selektivních činidel po 4 h, a vyočkování na chromogenní agar a Oxford/PALCAM.

CO ZDE NEUVÁDÍME. Složení půd a činidel (příl. B), podrobnosti druhé selektivní půdy, úplná kritéria odečtu druhé půdy, podrobnosti konfirmačních zkoušek (příl. C a D), charakteristiky metody (citlivost, specificita, LOD50, kap. 11) ani záznamy zabezpečování kvality (kap. 13) — neuvádíme, protože jsou mimo dostupný text (náhled sahá do bodu 9.4.2) nebo v citovaných normách (ISO 6887, ISO 7218, ISO 11133).

Princip metody

Listeria se může vyskytovat v malém počtu vedle početnějších jiných mikroorganismů, proto je metoda kultivační a selektivní a její první etapa se sníženou koncentrací inhibitorů oživuje oslabené buňky. Navážený podíl se suspenduje v polovičním Fraserově bujónu (primární pomnožení), poté se převede do plného Fraserova bujónu (sekundární pomnožení). Z obou kultur se vyočkují dvě selektivní pevné půdy: agar ALOA podle Ottavianiho a Agostiho a druhá selektivní půda s jiným principem. Kolonie typického vzhledu se potvrdí morfologickými a biochemickými zkouškami, které rozhodnou, zda je izolát L. monocytogenes, nebo jiná Listeria spp. Výsledek se uvádí jako přítomnost nebo nepřítomnost ve stanovené hmotnosti nebo objemu vzorku, nikoli jako počet.

Použití

• Produkty určené k lidské spotřebě a ke krmení zvířat (rozsah normy, kap. 1)
• Vzorky prostředí z oblasti výroby potravin a manipulace s potravinami (kap. 1)
• Kritérium bezpečnosti potravin pro L. monocytogenes v potravinách připravených k přímé spotřebě — „nepřítomnost v 25 g“ (nařízení (ES) č. 2073/2005, příl. I řádky 1.1 a 1.2)
• Zkoušení výrobního prostředí na přítomnost L. monocytogenes (nařízení (ES) č. 2073/2005, čl. 5 odst. 2; odběr podle ISO 18593)
• Průkaz celého rodu Listeria spp. vedle L. monocytogenes (rozšíření rozsahu ve vydání z roku 2017)

Klíčové parametry

Norma

Označení normy

PN-EN ISO 11290-1:2017-07

Název (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i innych Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania

Název (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method

Postup krok za krokem

1. Výchozí suspenze

   Ze zkušebního podílu (obvykle 25 g nebo 25 ml) a 225 g nebo 225 ml polovičního Fraserova bujónu připravte suspenzi o desetinásobném ředění; pro určité produkty použijte ISO 6887 (bod 9.1).

2. Primární pomnožení

   Inkubujte poloviční Fraserův bujón při 30 °C po dobu 25 h ± 1 h (bod 9.2). Během inkubace se může objevit černé zbarvení; vzorek lze uchovat při 5 °C až 72 h před převedením do Fraserova bujónu.

3. Sekundární pomnožení

   Převeďte 0,1 ml primární kultury do 10 ml Fraserova bujónu a inkubujte při 37 °C po dobu 24 h ± 2 h (bod 9.3). Při průkazu Listeria spp. jiných než L. monocytogenes může dalších 24 h zvýšit výtěžnost.

4. Vyočkování na pevné půdy

   Z primární kultury (po 25 h) a ze sekundární kultury (po 24 h) vyočkujte kličkou agar ALOA a druhou selektivní půdu tak, abyste získali dobře izolované kolonie (bod 9.4.1).

5. Inkubace pevných půd

   Obraťte plotny; agar ALOA inkubujte při 37 °C celkem 48 h ± 2 h, a jsou-li po 24 h ± 2 h vidět presumptivní kolonie, lze inkubaci ukončit; druhou půdu inkubujte podle výrobce (bod 9.4.1). Plotny po inkubaci lze uchovat při 5 °C až 48 h před odečtem.

6. Odečet kolonií

   Na ALOA označte modrozelené kolonie s neprůhledným halo (presumptivní L. monocytogenes, také L. ivanovii) a modrozelené s halo nebo bez (presumptivní Listeria spp.); druhou půdu hodnoťte podle jejích znaků (bod 9.4.2).

7. Potvrzení

   Přeočkujte presumptivní kolonie na neselektivní půdu a potvrďte: hemolýza, fermentace L-rhamnózy a D-xylózy, barvení podle Grama; fakultativně test CAMP, kataláza, pohyblivost a mikroskopický obraz. Potvrzení rozhodne, zda je izolát L. monocytogenes, nebo jiná Listeria spp. (kap. 4.5, předmluva).

8. Výsledek

   Uveďte přítomnost nebo nepřítomnost L. monocytogenes a/nebo Listeria spp. ve stanovené hmotnosti nebo objemu vzorku (kap. 3).

Potřebné vybavení a přístroje

Činidla, živné půdy a spotřební materiál

Bezpečnost a ochrana zdraví při práci (BOZP)

• Zkoušky na L. monocytogenes a Listeria spp. se provádějí pouze v náležitě vybavené laboratoři pod dohledem zkušeného mikrobiologa; důrazně se doporučují podmínky biologické bezpečnosti úrovně 2 (upozornění v normě)
• Důrazně se doporučuje informovat pracovnice o zvláštním nebezpečí pro vyvíjející se plod v důsledku infekce matky; těhotné ženy a osoby s nemocemi snižujícími buněčnou imunitu by neměly pracovat s kulturami L. monocytogenes a Listeria spp. (upozornění v normě)
• Zvláštní opatrnost při zneškodňování inkubovaných materiálů; norma nezahrnuje všechny aspekty bezpečnosti — pravidla BOZP stanoví laboratoř (upozornění v normě)

Časté dotazy