🧫 Celkový počet mikroorganismů při 30 °C — technika zalévání

Mikrobiologie PN-EN ISO 4833-1

Přehled

STAV (k 07.11.2026). PN-EN ISO 4833-1:2013-12 — polská verze vydaná 01.02.2017 (katalogový list PKN); zavádí EN ISO 4833-1:2013 a ISO 4833-1:2013 [IDT], nahrazuje PN-EN ISO 4833:2004 včetně opravy Ap1:2005; katalogový list neuvádí zrušení ani nahrazující normu. K normě byla vydána změna PN-EN ISO 4833-1:2013-12/A1:2022-06 (vydaná 23.06.2022; zavádí EN ISO 4833-1:2013/A1:2022 a ISO 4833-1:2013/Amd 1:2022). Změna se týká pouze kapitoly 1 (rozsah): nový rozsah je širší a obecnější než ve vydání z roku 2013. ISO 4833-1:2013 má v katalogu iTeh status „k revizi“ (odečteno 07.11.2026). Dostupný text je první vydání ISO 4833-1:2013 spolu s textem změny Amd 1:2022.

ROZSAH (kap. 1, ve znění změny A1). Norma uvádí horizontální metodu stanovení počtu mikroorganismů schopných růst a tvořit kolonie na pevné půdě po aerobní inkubaci při 30 °C. Používá se pro produkty určené k lidské spotřebě, pro krmiva (včetně krmiv pro zvířata v zájmovém chovu), pro vzorky prostředí z oblasti výroby potravin a krmiv a manipulace s nimi a pro vzorky z etapy prvovýroby. Technika je vhodná ke stanovení počtu mikroorganismů ve vzorcích, u nichž se na plotně napočítá nejméně 10 kolonií, což odpovídá očekávané kontaminaci nad 10 KTJ/ml u tekutých vzorků nebo 100 KTJ/g u pevných vzorků. Je zvlášť užitečná pro produkty vyžadující spolehlivý výsledek při nízké mezi stanovitelnosti, pro produkty s plazivými koloniemi překrývajícími jiné (například mléko a mléčné výrobky s plazivými Bacillus spp.) a pro produkty s bakteriemi citlivými na kyslík. U některých matric se výsledek může lišit od výsledku získaného metodou podle ISO 4833-2 (technika roztěru). První vydání ISO 4833-1 spolu s ISO 4833-2 nahradilo ISO 4833:2003.

PRINCIP (kap. 4). Stanovené množství tekutého zkoušeného vzorku nebo výchozí suspenze (u jiných produktů) se vnese do prázdné Petriho misky a smíchá s roztavenou agarovou půdou, čímž vznikne zalévaná plotna; další plotny se připraví za stejných podmínek z desetinných ředění vzorku nebo suspenze. Plotny se inkubují za aerobních podmínek při 30 °C po dobu 72 h. Počet mikroorganismů na gram nebo mililitr se vypočte z počtu kolonií na plotnách obsahujících méně než 300 kolonií.

PŮDA (kap. 5). Půdou je agar pro stanovení počtu mikroorganismů (PCA) o složení: enzymatický hydrolyzát kaseinu 5,0 g, kvasničný extrakt 2,5 g, bezvodá glukóza 1,0 g, agar od 9 g do 18 g, voda 1000 ml. Při zkoušení mléčných výrobků se přidává sušené odtučněné mléko 1,0 g na litr půdy. pH po sterilizaci má činit 7,0 ± 0,2 při 25 °C; půda se sterilizuje v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. Má-li se půda použít ihned, ochladí se ve vodní lázni na 44–47 °C; jinak se uchovává ve tmě při 5 ± 3 °C nejvýše 3 měsíce a před použitím se zcela roztaví a ochladí na 44–47 °C. Roztavená půda se neuchovává déle než 4 h. Ředicí roztok se používá podle ISO 6887 pro daný produkt. Očekávají-li se plazivé kolonie, nalije se po ztuhnutí přibližně 4 ml krycí půdy (kap. 5.4, bod 9.2.7).

POSTUP (kap. 9). Do dvou sterilních Petriho misek se přenese po 1 ml tekutého vzorku nebo po 1 ml výchozí suspenze (desetinásobné ředění); při několika ředěních lze použít jednu misku na ředění. Do další misky se vnese 1 ml desetinásobného ředění (tekutý produkt) nebo stonásobného (jiné produkty) a podle potřeby další ředění, pro každé novou pipetou. Volí se ředění dávající od 10 do 300 kolonií na plotně. Do každé misky se nalije od 12 ml do 15 ml agaru PCA o teplotě 44–47 °C; doba od dokončení přípravy výchozí suspenze (nebo desetinásobného ředění u tekutého produktu) do nalití půdy nepřekročí 45 min. Inokulum se s půdou promíchá otáčením misek a nechá se ztuhnout na chladné, vodorovné ploše. Plotny se obrátí a inkubují při 30 °C po dobu 72 h ± 3 h. Po inkubaci se ponechají plotny obsahující, je-li to možné, méně než 300 kolonií a počítají se všechny kolonie, i bodové, v rozptýleném světle. Plazivé kolonie se počítají jako jednotlivé; rozrůstají-li se na méně než čtvrtině plotny, počítají se kolonie na nedotčené části a přepočtou na celou plotnu, a rozrůstají-li se na více než čtvrtině — výsledek se vyřadí.

VÝSLEDEK (kap. 10). Počet mikroorganismů se vypočte podle ISO 7218; údaje o preciznosti se týkají ploten s počtem kolonií nad 15 a pod 300. Výsledek se uvádí v KTJ na gram nebo mililitr vzorku.

PŘEDPIS. Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 (konsolidované znění z 01.07.2026) uvádí EN ISO 4833-1 jako referenční metodu pro kritéria hygieny výrobního procesu „počet aerobních mikroorganismů“. Tato kritéria se týkají masa a jatečně upravených těl, nikoli výrobků připravených k přímé spotřebě ani šťáv: jatečně upravená těla skotu, ovcí, koz a koní (řádek 2.1.1, denní logaritmický průměr m = 3,5, M = 5,0 log KTJ/cm², destruktivní vzorky), jatečně upravená těla prasat (2.1.2, m = 4,0, M = 5,0 log KTJ/cm²), mleté maso (2.1.6, m = 5 × 10⁵, M = 5 × 10⁶ KTJ/g, n = 5, c = 2) a strojně oddělené maso (2.1.7, stejné hodnoty). Kritérium pro mleté maso se nevztahuje na maso vyráběné v maloobchodě, je-li doba uchovávání kratší než 24 hodin. Alternativní metody jsou přípustné po validaci podle EN ISO 16140-2 (čl. 5).

DRUHÉ ZDROJE. Schéma metody ve školicích materiálech PIWet-PIB (2019) má stejné kroky: navážka → výchozí suspenze v ředicím roztoku → zalévání na PCA → inkubace při 30 °C po dobu 72 ± 3 h → odečet → interpretace → uvedení výsledků. Příručka FDA (BAM, kap. 3 „Aerobic Plate Count“) popisuje plotnovou metodu zalévání s poněkud jinými podmínkami: Butterfieldův fosfátový ředicí roztok, 12–15 ml agaru PCA ochlazeného na 45 ± 1 °C nalitého do 15 min od ředění, inkubace 48 ± 2 h při 35 °C (u mléka 32 °C) a rozsah počítání 15–300 kolonií na plotnu podle ISO.

CO ZDE NEUVÁDÍME. Přesný způsob výpočtu výsledku (ISO 7218), číselné údaje o preciznosti (kap. 10.2 a příl. A), podmínky přípravy výchozí suspenze a ředění pro jednotlivé produkty (ISO 6887) ani požadavky na zkoušení vhodnosti půdy (ISO 11133) — neuvádíme, protože jsou mimo text této normy nebo v citovaných normách.

Princip metody

Stanovené množství tekutého zkoušeného vzorku nebo výchozí suspenze se vnese do prázdné Petriho misky a smíchá s roztavenou agarovou půdou, čímž vznikne zalévaná plotna. Další plotny se připraví za stejných podmínek z desetinných ředění vzorku nebo výchozí suspenze. Plotny se inkubují za aerobních podmínek při 30 °C po dobu 72 h, poté se počet mikroorganismů na gram nebo mililitr vypočte z počtu kolonií na plotnách obsahujících méně než 300 kolonií. Metoda nerozlišuje rody ani druhy mikroorganismů — uvádí celkový počet těch, které za popsaných podmínek tvoří kolonie.

Použití

• Produkty určené k lidské spotřebě a ke krmení zvířat, včetně krmiv pro zvířata v zájmovém chovu (rozsah normy ve znění změny A1, kap. 1)
• Vzorky prostředí z oblasti výroby potravin a krmiv a manipulace s nimi a vzorky z etapy prvovýroby (kap. 1, změna A1)
• Produkty vyžadující spolehlivý výsledek při nízké mezi stanovitelnosti (kap. 1)
• Produkty s plazivými koloniemi překrývajícími jiné, například mléko a mléčné výrobky s plazivými Bacillus spp. (kap. 1)
• Kritéria hygieny výrobního procesu „počet aerobních mikroorganismů“ u masa a jatečně upravených těl — EN ISO 4833-1 jako referenční metoda (nařízení (ES) č. 2073/2005, příl. I kap. 2.1)

Klíčové parametry

Norma

Označení normy

PN-EN ISO 4833-1:2013-12 + A1:2022-06

Název (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 1: Oznaczanie liczby metodą posiewu wgłębnego w temperaturze 30 stopni C

Název (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique

Postup krok za krokem

1. Příprava půdy PCA

   Rozpusťte složky nebo hotovou půdu ve vodě, upravte pH tak, aby po sterilizaci činilo 7,0 ± 0,2 při 25 °C, a sterilizujte v autoklávu při 121 °C po dobu 15 min. Před použitím ochlaďte v lázni na 44–47 °C; roztavenou půdu neuchovávejte déle než 4 h (bod 5.3.2).

2. Výchozí suspenze a ředění

   Připravte výchozí suspenzi a desetinná ředění podle ISO 6887 pro daný produkt (bod 9.1).

3. Očkování misek

   Do dvou sterilních misek přeneste po 1 ml tekutého vzorku nebo výchozí suspenze (desetinásobné ředění) a do dalších misek 1 ml desetinásobného ředění (tekutý produkt) nebo stonásobného (jiné) a dalších ředění, pro každé novou pipetou. Zvolte ředění dávající 10–300 kolonií na plotně (bod 9.2.1–9.2.4).

4. Zalití půdou

   Do každé misky nalijte 12–15 ml agaru PCA o teplotě 44–47 °C; doba od dokončení přípravy výchozí suspenze do nalití půdy nesmí překročit 45 min (bod 9.2.5).

5. Promíchání a ztuhnutí

   Promíchejte inokulum s půdou otáčením misek a nechte ztuhnout na chladné, vodorovné ploše. Očekávají-li se plazivé kolonie, nalijte po ztuhnutí přibližně 4 ml krycí půdy (bod 9.2.6–9.2.7).

6. Inkubace

   Obraťte plotny a inkubujte při 30 °C po dobu 72 h ± 3 h (bod 9.2.8).

7. Počítání kolonií

   Ponechte plotny obsahující, je-li to možné, méně než 300 kolonií a spočítejte všechny kolonie, i bodové, v rozptýleném světle. Plazivé kolonie počítejte jako jednotlivé; při rozrůstání na méně než čtvrtině plotny počítejte nedotčenou část a přepočtěte, při více — vyřaďte (bod 9.3).

8. Výsledek

   Vypočtěte počet mikroorganismů na gram nebo mililitr vzorku podle ISO 7218 (kap. 10).

Potřebné vybavení a přístroje

Činidla, živné půdy a spotřební materiál

Bezpečnost a ochrana zdraví při práci (BOZP)

• Norma neobsahuje požadavky BOZP; pravidla práce s kulturami smíšené mikroflóry z potravin stanoví laboratoř na základě posouzení rizik
• Práce s roztaveným agarem o teplotě 44–47 °C a s autoklávem — opatření proti horku a tlaku volí laboratoř

Časté dotazy