🍎 维生素 C — HPLC
以高效液相色谱（HPLC）配紫外检测测定食品中的抗坏血酸（维生素 C）。重要的营养价值参数。
要点速览
- 标准: PN-EN 14130:2004
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 6
- 各步骤合计时间: 1 小时 25 分钟
- 测量范围: 1–1000 mg/100 g
- 检出限: 0,5 mg/100 g
- 检测波长: 245 nm
概述
维生素 C（L-抗坏血酸）是必需营养素、抗氧化剂，也是食品标签上最常声称的成分之一。PN-EN 14130 方法是用于测定食品中总抗坏血酸和脱氢抗坏血酸（经 DTT 还原后）的基准色谱方法（HPLC-UV）。
方法包括用偏磷酸（稳定剂）从样品中提取维生素 C、用二硫苏糖醇（DTT）将氧化型（DHAA）还原、在 C18 色谱柱上以缓冲流动相分离，并在 245 nm 处紫外检测。测量范围：1–1000 mg/100 g。
方法原理
将样品与偏磷酸（HPO₃）溶液一起均质，以防止维生素 C 氧化。离心后用 DTT（二硫苏糖醇）处理上清液，将 DHAA 还原为抗坏血酸。溶液经过滤（0,22 µm）后用 HPLC 在 C18 柱上分析，流动相为 50 mmol/L KH₂PO₄，pH 2,5。245 nm 紫外检测。用校准曲线（L-抗坏血酸，CRM）定量。
应用领域
- 食品标签控制 — 维生素 C 声称（欧盟 1169/2011 号法规）
- 果蔬汁分析
- 强化食品和膳食补充剂分析
- 婴幼儿食品质量控制
- 稳定性研究 — 维生素 C 随时间的降解
- 新鲜和冷冻果蔬分析
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 测量范围 | 1–1000 mg/100 g |
| 检出限 | 0,5 mg/100 g |
| 检测波长 | 245 nm |
| 精密度（CV） | 2–5% |
| 分析时间 | 每样 10–15 min |
标准
- 标准编号
- PN-EN 14130:2004
- 标准名称（波兰语）
- Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC
- 标准名称（英语）
- Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC
分步操作程序
-
提取
称取 5–10 g 样品。加入 50 mL 3% HPO₃。均质 2 min。10 000 g 离心 10 min。
-
DHAA 还原
向 5 mL 上清液中加入 1 mL DTT（40 mg/mL）。室温避光孵育 30 min。
-
过滤
经 0,22 µm PVDF 滤器过滤至 HPLC 小瓶。
-
校准
在 3% HPO₃ 中配制抗坏血酸标准液：5、10、25、50、100 mg/L。
-
HPLC 分析
C18 柱，流动相：50 mM KH₂PO₄ pH 2,5 + 2% MeOH，流速 1 mL/min，检测 245 nm。
-
计算
由校准曲线读取浓度。换算为每 100 g 样品的 mg 数。计入稀释倍数。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统 | Agilent 1260 Infinity II、Shimadzu Nexera、Waters Alliance | 200 000–400 000 PLN |
| C18 色谱柱 | Waters Atlantis T3 150×4,6 mm，5 µm | 2 000–4 000 PLN |
| 自动进样器 | HPLC 系统集成 | 系统集成 |
| 实验室离心机 | Eppendorf 5804R、Hettich Rotina 380R | 10 000–30 000 PLN |
| 均质机 | IKA Ultra-Turrax T25、Kinematica PT 3100 | 5 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| L-抗坏血酸（标准品） | 50-81-7 | 纯度 ≥99%，校准用有证 CRM |
| 偏磷酸 HPO₃ | 37267-86-0 | 3–5% 溶液，维生素 C 稳定剂，防止氧化 |
| 二硫苏糖醇（DTT） | 3483-12-3 | 将 DHAA 还原为抗坏血酸，40 mg/mL 溶液 |
| 磷酸二氢钾 KH₂PO₄ | 7778-77-0 | 流动相：50 mmol/L，pH 2,5（用 H₃PO₄ 酸化） |
| 甲醇 HPLC 级 | 67-56-1 | 流动相添加剂（2–5%） |
职业健康与安全
- 偏磷酸 — 有刺激性，须戴手套和护目镜
- 甲醇 — 有毒、易燃。须在通风柜中操作。
- DTT — 有刺激性、气味不佳。须在排风下操作。
- HPLC 废液 — 单独收集（有机废液）
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN 14130:2004 — 《Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC》。
该方法的原理是什么？
将样品与偏磷酸（HPO₃）溶液一起均质，以防止维生素 C 氧化。离心后用 DTT（二硫苏糖醇）处理上清液，将 DHAA 还原为抗坏血酸。
测量范围和准确度是多少？
测量范围：1–1000 mg/100 g；检出限：0,5 mg/100 g；检测波长：245 nm；精密度（CV）：2–5%。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 小时 25 分钟。整个程序共 6 个步骤。
需要哪些设备？
带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统、C18 色谱柱、自动进样器、实验室离心机、均质机。核心仪器的参考价格（带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统）：200 000–400 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
食品标签控制 — 维生素 C 声称（欧盟 1169/2011 号法规）；果蔬汁分析；强化食品和膳食补充剂分析；婴幼儿食品质量控制；稳定性研究 — 维生素 C 随时间的降解；新鲜和冷冻果蔬分析。
需要采取哪些安全防护措施？
偏磷酸 — 有刺激性，须戴手套和护目镜；甲醇 — 有毒、易燃。须在通风柜中操作。；DTT — 有刺激性、气味不佳。须在排风下操作。；HPLC 废液 — 单独收集（有机废液）。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN 14130。