🦠 食品中弧菌属

微生物 PN-EN ISO 21872-1

通过 ASPW 增菌和 TCBS 琼脂分离，检测食品中潜在肠道致病性弧菌属（副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌）。

概述

弧菌属（Vibrio）是革兰氏阴性、嗜盐的细菌属，天然存在于海水和河口水域。三个主要的肠道致病种为：副溶血性弧菌 — 与海产品相关的最常见细菌性食物中毒病因（腹泻、绞痛、发热，食用后 12–24 h 出现）；霍乱弧菌 — 霍乱病原（O1 和 O139 血清群）以及较轻的胃肠炎（非 O1/非 O139 菌株）；创伤弧菌 — 最危险的种，可引起败血症，肝病患者病死率超过 50%。

PN-EN ISO 21872-1 标准描述了检测食品（主要为海产品：蛤、牡蛎、虾、鱼）和环境样品中这三种弧菌的水平法。方法包括在碱性盐胨水（ASPW — Alkaline Saline Peptone Water）中选择性增菌、在 TCBS（硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂）及第二种选择性培养基上分离，以及生化和/或分子（PCR）确证。

ASPW 提供碱性（pH 8,6）和含盐（NaCl 2–3%）条件，有利于弧菌生长，同时抑制许多其他细菌。TCBS 琼脂是高度选择性培养基——胆盐和蔗糖可区分弧菌种：副溶血性弧菌（蓝绿色菌落，蔗糖阴性）、霍乱弧菌（黄色菌落，蔗糖阳性）、创伤弧菌（绿色菌落，蔗糖阴性）。

由于气候变暖，弧菌检验日益重要——弧菌正向新的水域扩散（波罗的海、北海）。在欧盟，海产品和贝类的官方控制中要求进行该检验。

方法原理

样品在两份连续的 ASPW（碱性盐胨水，pH 8,6，NaCl 2–3%）中增菌。第一增菌阶段：41,5°C/6 h 和/或 37°C/6 h。第二阶段：转入新鲜 ASPW，41,5°C/18 h（副溶血性弧菌、霍乱弧菌）或 37°C/18 h（创伤弧菌）。ASPW 的高 pH 和盐度选择性地促进弧菌生长。增菌后划线接种于 TCBS 琼脂（37°C/24 h）和第二种培养基。在 TCBS 上副溶血性弧菌形成蓝绿色菌落（蔗糖 −），霍乱弧菌呈黄色（蔗糖 +），创伤弧菌呈绿色（蔗糖 −）。确证：生化试验（氧化酶 +、含 NaCl 生长、V-P 反应）和/或 PCR（毒力基因：副溶血性弧菌 tdh、trh；霍乱弧菌 ctx）。

应用领域

• 海产品质量控制 — 蛤、牡蛎、贻贝、虾
• 鱼和鱼制品检验，尤其是生食（寿司、刺身）
• 贝类采收区海水和河口水域监测
• 进口海产品官方控制
• 食用海产品后暴发事件的流行病学调查
• 气候监测 — 追踪弧菌向新水域（波罗的海）的扩散
• 含海产品的沙拉和菜肴检验（即食）

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 21872-1:2017

标准名称（波兰语）

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania Vibrio spp. — Część 1: Wykrywanie potencjalnie enteropatogennych Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae i Vibrio vulnificus

标准名称（英语）

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus

分步操作程序

1. 样品制备

   称取 25 g 样品（海产品）于均质袋中。加入 225 mL ASPW（pH 8,6）。均质 60–120 s。

   ⏱ 时间: 10 min

2. 增菌 — 第一阶段

   于 41,5 ± 1°C 培养 6 h（副溶血性弧菌、霍乱弧菌）。可同时将另一份于 37 ± 1°C 培养 6 h（创伤弧菌）。

   ⏱ 时间: 6 h • 🌡 温度: 41,5°C / 37°C

3. 增菌 — 第二阶段

   从增菌液取 1 mL 转入 10 mL 新鲜 ASPW。于 41,5°C 培养 18 h（副溶血性弧菌、霍乱弧菌）或 37°C 培养 18 h（创伤弧菌）。

   ⏱ 时间: 18 h • 🌡 温度: 41,5°C / 37°C

4. TCBS 分离

   从增菌液划线接种至 TCBS 琼脂平板和第二种选择性培养基（如显色培养基）。于 37 ± 1°C 培养 24 ± 2 h。注意：TCBS 琼脂切勿高压灭菌 — 煮沸溶解后直接倾注平板。

   ⏱ 时间: 24 h • 🌡 温度: 37°C

5. TCBS 上菌落读取

   寻找典型菌落：副溶血性弧菌 — 蓝绿色，2–3 mm；霍乱弧菌 — 黄色、光滑，2–3 mm；创伤弧菌 — 绿色，1–2 mm。

   ⏱ 时间: 15 min

6. 非选择性培养基传代

   从每个平板挑取至少 3–5 个典型菌落。传代至含 NaCl 的琼脂（TSA + 1% NaCl）。37°C 培养 24 h。

   ⏱ 时间: 24 h • 🌡 温度: 37°C

7. 确证试验

   进行：氧化酶试验（+）、不同 NaCl 浓度（0%、3%、6%、8%、10%）生长试验、蔗糖发酵试验、V-P 反应、拉丝试验。或用 PCR 确证（基因：副溶血性弧菌 tlh/tdh/trh；霍乱弧菌 ctx/ompW；创伤弧菌 vvhA）。

   ⏱ 时间: 24–48 h

8. 报告

   结果："在 25 g 中检出/未检出副溶血性弧菌/霍乱弧菌/创伤弧菌"。注明种及毒力因子谱（若做了 PCR）。

   ⏱ 时间: 10 min

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 霍乱弧菌 — BSL-2 病原菌（非 O1/非 O139 菌株）或 BSL-3（O1/O139），须遵守生物安全规范
• 创伤弧菌 — 肝病患者病死率 >50%，有伤口时须格外小心
• 仅可在 II 级生物安全柜中操作
• TCBS 中的胆盐 — 有刺激性，佩戴手套和护目镜
• 使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
• 用 70% 乙醇对台面消毒 — 弧菌对干燥敏感

常见问题