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🌿 Microtox® 试验 — 费氏弧菌

环境 PN-EN ISO 11348-3

基于费氏弧菌（Aliivibrio fischeri）发光抑制的水和废水毒性生物试验。快速毒性筛查（15–30 min）。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 11348-3:2008
  • 类别: 环境
  • 操作步骤数: 6
  • 各步骤合计时间: 1 小时 20 分钟
  • 受试生物: 费氏弧菌（Aliivibrio fischeri），NRRL B-11177
  • 暴露时间: 15 和 30 min
  • 终点: EC50 或发光抑制率 %

概述

Microtox® 试验（及其等效方法）是评估水、废水以及土壤和废物水提取液毒性最快速、最常用的生物测定。费氏弧菌（Vibrio fischeri，旧称 Photobacterium phosphoreum）因具有荧光素酶而天然发光。有毒物质抑制细菌代谢，使发光强度下降。

结果为暴露 15 和 30 分钟后的 EC50（引起发光下降 50% 的浓度），或对环境样品给出发光抑制百分率。该试验用于废物分类（毒性 H14）、废水毒性评估和水质控制。

方法原理

将冻干的费氏弧菌用盐溶液（2% NaCl）复苏，暴露于样品的系列稀释液中。用发光仪在加入样品前（I₀）以及暴露 5、15、30 分钟后（I_t）测量发光。抑制率 = [1 −（I_t/I_对照）] × 100。EC50 由剂量-反应曲线计算。试验温度：15°C（费氏弧菌最适温度）。

应用领域

关键参数

参数数值
受试生物费氏弧菌（Aliivibrio fischeri），NRRL B-11177
暴露时间15 和 30 min
终点EC50 或发光抑制率 %
试验温度15 ± 1°C
试验用时30–45 min（含制备）

标准

标准编号
PN-EN ISO 11348-3:2008
标准名称（波兰语）
Jakość wody — Oznaczanie hamowania bioluminescencji Vibrio fischeri (test hamowania świecenia) — Część 3: Metoda z zastosowaniem bakterii liofilizowanych
标准名称（英语）
Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria

分步操作程序

  1. 样品制备

    将样品 pH 调至 6–8（必要时）。将盐度调至 2% NaCl。含悬浮物时过滤（0,45 µm）。

    ⏱ 时间: 15 min

  2. 细菌复苏

    向冻干安瓿中加入 1 mL 已冷却的复苏液。轻轻混匀。在 4°C 孵育 15 min。

    ⏱ 时间: 15 min • 🌡 温度: 4°C

  3. 配制稀释液

    在 2% NaCl 中配制样品稀释系列：100、50、25、12,5、6,25%。对照 = 2% NaCl。

    ⏱ 时间: 10 min

  4. 测量初始发光 I₀

    将细菌液分装至测量瓶（每瓶 100 µL）。在发光仪中测量初始发光 I₀。

    ⏱ 时间: 5 min

  5. 加入样品

    向含细菌的小瓶中加入 900 µL 样品/稀释液。轻轻混匀。

    ⏱ 时间: 5 min

  6. 15 和 30 min 后测量

    测量发光 I₁₅ 和 I₃₀。计算抑制率 % 和 EC50。

    ⏱ 时间: 30 min • 🌡 温度: 15°C

所需设备与仪器

设备示例参考价格
Microtox® 发光仪Modern Water Microtox M500、LUMIStox 300（Hach）60 000–120 000 PLN
15°C 冷却模块发光仪内置或外置内置
移液器Eppendorf Research Plus 10–1000 µL800–2 000 PLN
发光仪用比色皿/小瓶硼硅玻璃小瓶，500 只装500–1 000 PLN

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
冻干费氏弧菌—Microtox Acute Reagent，安瓿装（每支 5 次试验），-20°C 保存
复苏液—2% NaCl，无菌，冷却至 4°C
稀释液—2% NaCl，用于配制样品稀释液
参比物质7778-50-9重铬酸钾 K₂Cr₂O₇ 或 ZnSO₄，用于验证细菌敏感性

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 11348-3:2008 — 《Water quality — Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) — Part 3: Method using freeze-dried bacteria》。

该方法的原理是什么？

将冻干的费氏弧菌用盐溶液（2% NaCl）复苏，暴露于样品的系列稀释液中。用发光仪在加入样品前（I₀）以及暴露 5、15、30 分钟后（I_t）测量发光。

测量范围和准确度是多少？

受试生物：费氏弧菌（Aliivibrio fischeri），NRRL B-11177；暴露时间：15 和 30 min；终点：EC50 或发光抑制率 %；试验温度：15 ± 1°C。

完成检测需要多长时间？

各步骤所列时间合计约为 1 小时 20 分钟。整个程序共 6 个步骤。

需要哪些设备？

Microtox® 发光仪、15°C 冷却模块、移液器、发光仪用比色皿/小瓶。核心仪器的参考价格（Microtox® 发光仪）：60 000–120 000 PLN。

该检测用于哪些场景？

工业废水毒性筛查；废物生态毒性分类（H14/HP14）；污染土壤水提取液毒性评估；地表水毒性监测；污水处理工艺效能控制；化学品毒性快速评估（REACH）。

需要采取哪些安全防护措施？

重铬酸钾 — 致癌，须在通风柜中使用；费氏弧菌 — BSL-1，生物风险低；样品可能含有毒物质 — 佩戴丁腈手套；试验废物 — 收集于生物废物容器中。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 11348-3。

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