🦠 肉中的Trichinella（旋毛虫）幼虫——磁力搅拌器人工消化法
三句话速览
向100 g绞碎的肉（混合样品）中加入2 l消化液（16 ml 25 %盐酸 + 10 g胃蛋白酶1:10 000 NF，溶于45 ± 2 °C的水中），在磁力搅拌器上消化30 min（最长60 min），经180–200 µm筛网过滤入分液漏斗，沉降30 min，收集40 ml沉渣，10 min后留下10 ml，在带方格的培养皿中用体视显微镜（10–20×，≥ 10 min）观察；结果：在x g中有无幼虫。该检测依据 PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023)；样品：合并样最多100 g肌肉（+ 至多15 g），不含脂肪、肌腱和筋膜；合并样较小时 → 最少1 l消化液。整个程序共 9 个步骤；主要用于：屠宰场和分割厂对猪、马和野猪肉进行旋毛虫的官方检验（按第2015/1375号条例（欧盟）为参比方法）、检验至多100 g的混合样品（如100份各1 g的样品），并可通过消化越来越小的合并样追溯到来源胴体、野生动物（狐狸、貉、熊）的监测——也包括延长沉降时间的冷冻样品。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 9
- 样品: 合并样最多100 g肌肉（+ 至多15 g），不含脂肪、肌腱和筋膜；合并样较小时 → 最少1 l消化液
- 消化液: 2 l水45 ± 2 °C + 16 ml 25 %盐酸（37 %时为11 ml）+ 10 g胃蛋白酶1:10 000 NF或30 ml 660 U/ml液体胃蛋白酶；顺序为水 → 酸 → 胃蛋白酶
- 消化: 45 ± 2 °C，30 min（最长60 min），磁力搅拌器形成深涡旋；筛网上的残留 ≤ 样品质量的5 %
概述
ISO 18743:2015规定了用磁力搅拌器人工消化法检测肉中Trichinella（旋毛虫）幼虫的方法。样品必须不含脂肪、肌腱和筋膜（舌头需去除坚硬的结缔组织层）；单份样品的大小由主管当局确定，来自各动物的样品可以合并——供消化的肌肉合并样最大质量为100 g，必要时可再加至多15 g；合并样较小时（如50 g），消化液的体积和组成可按比例减少至最少1 l。样品应取自好发肌肉（猪——膈肌脚或咬肌；马——咬肌、膈肌、舌；野猪——膈肌、前肢、舌），取样质量应为检验所需的两倍，尽快检验或保存于2–8 °C，不得冷冻。冷冻样品（如野生动物监测）检验时沉降时间延长至60 min，因为死亡的幼虫会从螺旋形舒展开而下沉较慢；此时应增加称样量。结果以样品x克中有无Trichinella幼虫表示；所有可疑发现物均应在60–100×下观察，阳性幼虫建议送交显微镜和分子（PCR）鉴定至种／基因型。
在欧盟，委员会第2015/1375号实施条例（欧盟）（经2022/1418修改后的文本）在附件I第I章中把ISO 18743:2015标准指定为检测旋毛虫的参比方法，并在第II章中描述了等效方法（例如在Stomacher 3500均质器中用1.5升40–41 °C的水、25 ml 17.5 %盐酸和6 g胃蛋白酶消化25 min；直径11 cm的180 µm筛网；20–70 °C范围内分度0.5 °C的温度计；± 0.1 g的天平）。胃蛋白酶的效价应为1:10 000 NF（相当于1:12 500 BP和2 000 FIP），或液体形式至少660 U/ml；若最终消化液的活性相当于10 g 1:10 000 NF胃蛋白酶，则允许使用其他活性的制剂（ISO 18743第5.3条）。委员会关于旋毛虫实验室审核的指南会检查诸如是否采用磁力搅拌器法、筛孔180 µm、胃蛋白酶和酸的质量以及沉降时间等项。在波兰该标准以PN-EN ISO 18743:2015-11连同修改单A1:2024-02施行。
方法原理
肉在搅拌机／绞肉机中绞碎，每100 g加入50–100 ml消化液或自来水（45 ± 2 °C）——通常点动三次、每次5–10 s，不可更久，以免损伤幼虫。消化液须现配：向2 l加热至45 ± 2 °C的自来水中加入16 ml 25 %盐酸（若用37 %盐酸则为11 ml），开启搅拌，然后加入10 g粉状／颗粒状胃蛋白酶（1:10 000 NF）或30 ml液体胃蛋白酶（660 U/ml）；水 → 酸 → 胃蛋白酶的顺序是强制性的，因为它可保护胃蛋白酶不被浓酸分解。把绞碎的肉移入盛有消化液的3 l烧杯（器具用消化液冲洗），烧杯用铝箔盖好，在45 ± 2 °C下消化30 min，搅拌至形成深涡旋而不溅出；时间最长可延长至60 min。把液体经180–200 µm筛网倒入分液漏斗（烧杯和筛网用不少于100 ml水冲洗）；当筛网上主要留下不可消化的组织（筋膜、结缔组织）且其量不超过样品质量的5 %时，即认为消化令人满意——否则应重复该操作。沉降30 min后，迅速完全打开分液漏斗的旋塞，把约40 ml（初级沉渣）放入试管，静置10 min，吸去30 ml上清液，留下不超过10 ml（次级沉渣），连同10 ml冲洗液一并倒入带方格的培养皿；至少1 min后检查透明度（方格线是否清晰），并在体视显微镜或旋毛虫镜下以10–20×放大倍数逐格系统地观察至少10 min；浑浊的沉渣可再次稀释至40 ml、沉降10 min并吸至10 ml以澄清。检验应在消化后立即进行（最迟当天，培养皿置于冰箱）；找到的幼虫移入盛有70–90 %乙醇的1–2 ml小瓶中。
应用领域
- 屠宰场和分割厂对猪、马和野猪肉进行旋毛虫的官方检验（按第2015/1375号条例（欧盟）为参比方法）
- 检验至多100 g的混合样品（如100份各1 g的样品），并可通过消化越来越小的合并样追溯到来源胴体
- 野生动物（狐狸、貉、熊）的监测——也包括延长沉降时间的冷冻样品
- 按欧盟委员会指南接受审核的兽医和官方实验室
- 质量文件：实验室记录卡（胃蛋白酶批号、消化时间、筛网上的残留、结果）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 样品 | 合并样最多100 g肌肉（+ 至多15 g），不含脂肪、肌腱和筋膜；合并样较小时 → 最少1 l消化液 |
| 消化液 | 2 l水45 ± 2 °C + 16 ml 25 %盐酸（37 %时为11 ml）+ 10 g胃蛋白酶1:10 000 NF或30 ml 660 U/ml液体胃蛋白酶；顺序为水 → 酸 → 胃蛋白酶 |
| 消化 | 45 ± 2 °C，30 min（最长60 min），磁力搅拌器形成深涡旋；筛网上的残留 ≤ 样品质量的5 % |
| 筛网与沉降 | 筛孔180–200 µm；分液漏斗 ≥ 2.5 l；30 min（冷冻样品至60 min）；初级沉渣40 ml，10 min；次级沉渣 ≤ 10 ml |
| 读数 | 体视显微镜／旋毛虫镜10–20×，90 mm带方格培养皿（方格约1 cm），≥ 10 min；可疑物60–100× |
| 结果 | 样品x g中有无Trichinella幼虫；幼虫置于70–90 %乙醇中，进行种的鉴定（PCR） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie larw włośni Trichinella w mięsie metodą wytrawiania
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method
分步操作程序
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采样与样品制备
采取好发肌肉（猪：膈肌脚或咬肌），质量为检验所需的两倍；去除脂肪、肌腱、筋膜。检查质量、状态和标识；立即检验或保存于2–8 °C，不得冷冻。供消化的合并样：最多100 g（+ 至多15 g）。
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绞碎
把肉在搅拌机／绞肉机中绞碎，每100 g加50–100 ml消化液或45 ± 2 °C的水，通常点动三次、每次5–10 s——不可更久，以免损伤幼虫。
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消化液（现配）
向烧杯中2 l 45 ± 2 °C的自来水中加入16 ml 25 %盐酸（用37 %时为11 ml），在磁力搅拌器上开启搅拌，加入10 g胃蛋白酶1:10 000 NF或30 ml 660 U/ml液体胃蛋白酶。顺序：水、酸、胃蛋白酶。
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消化
把肉移入盛有消化液的3 l烧杯，用消化液冲洗搅拌机，盖上铝箔，维持45 ± 2 °C（用温度计监控）并搅拌至形成深涡旋而不溅出。消化30 min；必要时延长，总计最长60 min。
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过滤
在旋塞关闭的状态下把液体经180–200 µm筛网倒入分液漏斗；用不少于100 ml水冲洗烧杯和筛网。若筛网上留下的量超过样品质量的5 %或有未消化的肌肉——应重复消化（把剩余部分继续消化并另行检验，或重新采样）。
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沉降与收集沉渣
沉降30 min（可每10 min轻轻敲击漏斗；冷冻样品——至60 min）。迅速完全打开旋塞，把约40 ml初级沉渣放入试管，静置10 min，吸去30 ml上清液，留下不超过10 ml次级沉渣（如浑浊：加30 ml水，10 min，重复一次）。
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显微镜检验
把次级沉渣倒入带方格的培养皿，用10 ml水冲洗试管，静候不少于1 min。检查透明度（方格线是否清晰）；必要时澄清（补至40 ml，10 min，吸至10 ml）。在10–20×下逐格观察至少10 min，其间不得搅动液体；可疑物在60–100×下观察。应立即检验，最迟当天（培养皿置于冰箱）。
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结果与阳性样的处理
报告样品x g中有无Trichinella幼虫。把幼虫移入盛有70–90 %乙醇的1–2 ml小瓶并送交鉴定（显微镜、PCR）。合并样阳性时，对更大样品消化越来越小的合并样，直至指认到胴体。填写实验室记录卡（胃蛋白酶——批号、消化时间、筛网上的残留、结果）。
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去污
可能含有幼虫的液体、冲洗液、玻璃器皿和器具，在倾倒或清洗前应加热至 ≥ 70 °C或用化学方法消毒（如有效氯0.01 %的次氯酸钠处理 ≥ 3 h）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 带可调加热板的磁力搅拌器（或置于培养箱中）和 ≥ 5 cm的搅拌子 | 维持45 ± 2 °C和涡旋 | — |
| 搅拌机／绞肉机 | 加50–100 ml消化液绞碎，点动3次、每次5–10 s | — |
| ≥ 3 l玻璃烧杯、铝箔、± 0.5 °C温度计（20–70 °C） | 须用玻璃器皿——不得用塑料或聚四氟乙烯（幼虫会粘附） | — |
| 黄铜或不锈钢筛网180–200 µm（约10 cm）和 ≥ 15 cm漏斗 | 过滤消化液；筛网无需校准 | — |
| ≥ 2.5 l锥形玻璃分液漏斗配PTFE旋塞、50–100 ml试管／量筒、1/10/25 ml移液管 | 沉降和收集沉渣 | — |
| 带透射照明的体视显微镜或旋毛虫镜；90 mm带方格培养皿 | 建议配相机用于存档；盛放幼虫的小瓶 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 盐酸25 %（或37 %，12.1 mol/l） | — | 每2 l消化液加16 ml（或11 ml） |
| 粉状／颗粒状胃蛋白酶1:10 000 NF（= 1:12 500 BP，2 000 FIP）或 ≥ 660 U/ml液体胃蛋白酶 | — | 每2 l加10 g或30 ml——消化肌肉组织的酶 |
| 自来水45 ± 2 °C | — | 消化液的溶剂，冲洗器具 |
| 乙醇70–90 % | — | 在1–2 ml小瓶中固定找到的幼虫 |
| 次氯酸钠（有效氯0.01 %，≥ 3 h）或加热至 ≥ 70 °C | — | 检验后对液体和器具进行去污 |
职业健康与安全
- Trichinella幼虫对人具有侵袭性——对所有液体和器具进行去污（≥ 70 °C或次氯酸盐），戴手套，实验室内禁止进食
- 浓盐酸（25–37 %）——量取时须戴护目镜、手套并在通风柜中操作；始终把酸加入水中
- 粉状胃蛋白酶——避免吸入（致敏）；胃蛋白酶应在酸之后加入，绝不可加入浓酸中
- 45 °C的热液体和带加热板的搅拌器——倒入分液漏斗时要小心
- 大容量玻璃器皿（3 l烧杯、2.5 l分液漏斗）——有破碎和感染性材料溢出的风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 18743:2015-11 + A1:2024-02 (ISO 18743:2015 + Amd 1:2023) — 《Microbiology of the food chain — Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method》。
该方法的原理是什么？
肉在搅拌机／绞肉机中绞碎，每100 g加入50–100 ml消化液或自来水（45 ± 2 °C）——通常点动三次、每次5–10 s，不可更久，以免损伤幼虫。消化液须现配：向2 l加热至45 ± 2 °C的自来水中加入16 ml 25 %盐酸（若用37 %盐酸则为11 ml），开启搅拌，然后加入10 g粉状／颗粒状胃蛋白酶（1:10 000 NF）或30 ml液体胃蛋白酶（660 U/ml）；水 → 酸 → 胃蛋白酶的顺序是强制性的，因为它可保护胃蛋白酶不被浓酸分解。
测量范围和准确度是多少？
样品：合并样最多100 g肌肉（+ 至多15 g），不含脂肪、肌腱和筋膜；合并样较小时 → 最少1 l消化液；消化液：2 l水45 ± 2 °C + 16 ml 25 %盐酸（37 %时为11 ml）+ 10 g胃蛋白酶1:10 000 NF或30 ml 660 U/ml液体胃蛋白酶；顺序为水 → 酸 → 胃蛋白酶；消化：45 ± 2 °C，30 min（最长60 min），磁力搅拌器形成深涡旋；筛网上的残留 ≤ 样品质量的5 %；筛网与沉降：筛孔180–200 µm；分液漏斗 ≥ 2.5 l；30 min（冷冻样品至60 min）；初级沉渣40 ml，10 min；次级沉渣 ≤ 10 ml。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 9 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
带可调加热板的磁力搅拌器（或置于培养箱中）和 ≥ 5 cm的搅拌子、搅拌机／绞肉机、≥ 3 l玻璃烧杯、铝箔、± 0.5 °C温度计（20–70 °C）、黄铜或不锈钢筛网180–200 µm（约10 cm）和 ≥ 15 cm漏斗、≥ 2.5 l锥形玻璃分液漏斗配PTFE旋塞、50–100 ml试管／量筒、1/10/25 ml移液管、带透射照明的体视显微镜或旋毛虫镜；90 mm带方格培养皿。
该检测用于哪些场景？
屠宰场和分割厂对猪、马和野猪肉进行旋毛虫的官方检验（按第2015/1375号条例（欧盟）为参比方法）；检验至多100 g的混合样品（如100份各1 g的样品），并可通过消化越来越小的合并样追溯到来源胴体；野生动物（狐狸、貉、熊）的监测——也包括延长沉降时间的冷冻样品；按欧盟委员会指南接受审核的兽医和官方实验室；质量文件：实验室记录卡（胃蛋白酶批号、消化时间、筛网上的残留、结果）。
需要采取哪些安全防护措施？
Trichinella幼虫对人具有侵袭性——对所有液体和器具进行去污（≥ 70 °C或次氯酸盐），戴手套，实验室内禁止进食；浓盐酸（25–37 %）——量取时须戴护目镜、手套并在通风柜中操作；始终把酸加入水中；粉状胃蛋白酶——避免吸入（致敏）；胃蛋白酶应在酸之后加入，绝不可加入浓酸中；45 °C的热液体和带加热板的搅拌器——倒入分液漏斗时要小心；大容量玻璃器皿（3 l烧杯、2.5 l分液漏斗）——有破碎和感染性材料溢出的风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 18743。