🧬 STEC/VTEC — 产志贺毒素大肠埃希氏菌
用实时 PCR 法检测食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC/VTEC）— 检测毒力基因（stx1、stx2、eae）并确定 O157、O111、O26、O103、O145 血清群。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO/TS 13136:2013
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 1 天 23 小时 40 分钟–2 天 6 小时 10 分钟
- 增菌: 37 ± 1°C，18–24 h，BPW 或 mTSB + 新生霉素中
- 检测方法: 实时 PCR（qPCR）配 TaqMan 探针
- 毒力基因: stx1、stx2（志贺毒素）、eae（紧密黏附素）
概述
STEC（产志贺毒素大肠埃希氏菌），又称 VTEC（产志贺样毒素大肠埃希氏菌），是产生志贺毒素（Stx1 和/或 Stx2）的致病性大肠埃希氏菌菌株——属于最危险的食源性病原菌之一。STEC 感染可导致出血性肠炎（血性腹泻）和溶血性尿毒综合征（HUS），伴肾衰竭、血小板减少和溶血性贫血。HUS 病死率为 3–5%，患 HUS 的儿童中 25% 会出现永久性肾损伤。
最危险的血清群（所谓"Top 5"或"Big 6"）为：O157（最常见、最为人熟知）、O26、O111、O103 和 O145。感染源多为牛肉（生食或未熟透）、未经巴氏杀菌的乳、生芽苗（苜蓿、西兰花）、生菜和水。感染剂量极低——仅 10–100 个细胞即可致病。
PN-EN ISO/TS 13136 标准描述了基于实时 PCR 的 STEC 分子检测方法。这是食品中 STEC 唯一的标准化 PCR 方法。方法包括：样品增菌（18–24 h）、DNA 提取、毒力基因检测（stx1、stx2 — 志贺毒素基因；eae — 紧密黏附素基因，黏附蛋白）以及用实时 PCR 确定血清群（O157、O111、O26、O103、O145）。
若检出 stx 和 eae 基因且属于"Top 5"血清型，则需分离菌株，常采用免疫磁分离（IMS）。在欧盟，芽苗和发芽用种子必须进行该检验（（EC）2073/2005 号法规），某些国家还要求检验牛肉糜。2011 年德国的 STEC O104:H4 疫情危机（葫芦巴芽苗，>4000 例，54 人死亡）大幅强化了检验要求。
方法原理
三阶段法：（1）增菌 — 样品在增菌肉汤（如 BPW 或含新生霉素的 mTSB）中于 37°C 培养 18–24 h。（2）DNA 提取 — 从增菌液中提取 DNA（热裂解或提取试剂盒）。（3）实时 PCR — 使用荧光探针（TaqMan）进行实时 PCR 反应，检测：stx1 和 stx2 基因（志贺毒素）、eae 基因（紧密黏附素 — 黏附于肠上皮细胞）以及血清群基因（wzgA-O157、wzx-O111、wzx-O26、wzx-O103、wzx-O145）。若样品 stx + eae + "Top 5" 血清群均为阳性，则需分离 STEC 菌株，常采用包被抗 O 抗体磁珠的 IMS（免疫磁分离）。
应用领域
- 芽苗和发芽用种子控制 — （EC）2073/2005 号法规
- 牛肉糜检验（肉馅、肉排、汉堡饼）
- 未经巴氏杀菌的乳和生乳奶酪控制
- 生菜、叶菜和水果检验（即食）
- HUS/出血性肠炎暴发的流行病学调查
- 饮用水和娱乐用水监测
- 进口食品控制（尤其来自高流行地区）
- 食品安全控制计划中的检验（RASFF）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 增菌 | 37 ± 1°C，18–24 h，BPW 或 mTSB + 新生霉素中 |
| 检测方法 | 实时 PCR（qPCR）配 TaqMan 探针 |
| 毒力基因 | stx1、stx2（志贺毒素）、eae（紧密黏附素） |
| 血清群 | O157、O111、O26、O103、O145 |
| 分离（可选） | IMS（免疫磁分离）+ CT-SMAC / 显色培养基划线 |
| 灵敏度 | 1–10 CFU/25 g（增菌后） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO/TS 13136:2013
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
分步操作程序
-
样品制备与增菌
称取 25 g 样品，加入 225 mL 增菌肉汤（BPW 或含新生霉素的 mTSB）。在拍击式均质器中均质。于 37 ± 1°C 培养 18–24 h。
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DNA 提取
取 1 mL 增菌液。用提取试剂盒提取 DNA（硅胶柱、磁珠或热裂解：100°C/10 min）。测定 DNA 浓度和纯度（可选）。
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PCR 筛查 — 毒力基因
配制 3 个 PCR 反应（单重或多重）：stx1、stx2、eae。加入 DNA、引物、TaqMan 探针和 Master Mix。程序：95°C/10 min → 40 个循环（95°C/15 s，60°C/60 s）。分析荧光曲线 — Ct < 35 为阳性。
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PCR 筛查 — 血清群（若 stx 阳性）
若检出 stx1 和/或 stx2 — 配制 5 个血清群 PCR 反应：O157、O111、O26、O103、O145。热循环程序相同。阳性结果 = Ct < 35。
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筛查结果判读
情形：（A）stx+ / eae+ / Top5 血清群+ → 潜在阳性样品，需分离菌株。（B）stx+ / eae− 或血清群阴性 → 存在 STEC 但非 Top5，予以报告。（C）stx− → 阴性样品。
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菌株分离（IMS）
对情形（A）：向 1 mL 增菌液中加入 20 µL 免疫磁珠（相应血清群抗 O）。混匀孵育 15–30 min。磁力分离。洗涤 3 次。划线接种于 CT-SMAC（O157）或显色琼脂。
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分离株确证
从 CT-SMAC/显色平板挑取典型菌落（O157：山梨醇阴性、无色）。用 PCR 确证 — 分离株须具有 stx1/stx2 + eae + 相应血清群基因。可选：乳胶凝集试验（抗 O157 等）。
-
报告
筛查结果："在 25 g 中检出/未检出 STEC（stx+）"。若分离到菌株："自 25 g 样品中分离到 STEC O157:H7（stx2+、eae+）"。食品中阳性结果 = RASFF 通报。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 实时 PCR 仪 | Bio-Rad CFX96 Touch、Applied Biosystems 7500 Fast、Roche LightCycler 480 | 60 000–180 000 PLN |
| IMS 系统（免疫磁分离） | Dynabeads anti-E. coli O157 + 磁力架（Dynal MPC-S） | 5 000–15 000 PLN（磁力架）+ 2 000–4 000 PLN/盒磁珠 |
| 实验室离心机 | Eppendorf 5424 R、Hettich Mikro 200 R | 8 000–25 000 PLN |
| PCR 操作台（PCR 前） | Biosan UVT-S-AR、ESCO PCR Cabinet | 5 000–15 000 PLN |
| DNA 提取试剂盒 | Qiagen DNeasy Food Kit、Promega Wizard、PrepMan Ultra | 1 500–3 000 PLN / 50 次提取 |
| 37°C 培养箱 | Binder BD 56、Memmert INB 200 | 5 000–18 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| STEC 实时 PCR 试剂盒（stx1、stx2、eae） | — | 含引物、TaqMan 探针和对照的试剂盒：如 Bio-Rad iQ-Check STEC VirA、Romer RapidFinder STEC、Merck GeneDisc STEC；96 反应装 |
| 血清群 PCR 试剂盒（O157、O111、O26、O103、O145） | — | 针对 wzx/wzy 基因的单重或多重试剂盒（含引物/探针）；96 反应装 |
| PCR Master Mix（聚合酶 + dNTP + 缓冲液） | — | 如 Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix、TaqMan Universal Master Mix；200 反应装 |
| DNA 提取试剂盒 | — | 硅胶柱或磁珠法；如 Qiagen DNeasy、Promega Wizard；50 次提取装 |
| mTSB + 新生霉素（增菌肉汤） | — | 含新生霉素（20 mg/L）的改良胰酪大豆肉汤 — STEC 选择性增菌；500 g 装 + 补充剂 |
| 免疫磁珠（IMS） | — | Dynabeads anti-E. coli O157、O26、O111、O103、O145；5 mL 装（50 次反应） |
| CT-SMAC 琼脂（头孢克肟亚碲酸盐山梨醇麦康凯） | — | 用于分离大肠埃希氏菌 O157（山梨醇阴性）；500 g 装 + 补充剂 |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 备选增菌肉汤，500 g 装 |
职业健康与安全
- STEC — BSL-2 病原菌，感染剂量极低（10–100 个细胞！），须采取最高级别防护
- 培养物操作仅可在 II 级生物安全柜中进行
- 分设 PCR 前和 PCR 后区域 — 防止扩增产物污染
- 新生霉素 — 抗生素，避免皮肤接触
- 使用过的材料和培养物须先高压灭菌（121°C/30 min）再废弃
- 疑似 O157 时 — 考虑通报参比实验室
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO/TS 13136:2013 — 《Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups》。
该方法的原理是什么？
三阶段法：（1）增菌 — 样品在增菌肉汤（如 BPW 或含新生霉素的 mTSB）中于 37°C 培养 18–24 h。（2）DNA 提取 — 从增菌液中提取 DNA（热裂解或提取试剂盒）。
测量范围和准确度是多少？
增菌：37 ± 1°C，18–24 h，BPW 或 mTSB + 新生霉素中；检测方法：实时 PCR（qPCR）配 TaqMan 探针；毒力基因：stx1、stx2（志贺毒素）、eae（紧密黏附素）；血清群：O157、O111、O26、O103、O145。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 天 23 小时 40 分钟–2 天 6 小时 10 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
实时 PCR 仪、IMS 系统（免疫磁分离）、实验室离心机、PCR 操作台（PCR 前）、DNA 提取试剂盒、37°C 培养箱、II 级生物安全柜。核心仪器的参考价格（实时 PCR 仪）：60 000–180 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
芽苗和发芽用种子控制 — （EC）2073/2005 号法规；牛肉糜检验（肉馅、肉排、汉堡饼）；未经巴氏杀菌的乳和生乳奶酪控制；生菜、叶菜和水果检验（即食）；HUS/出血性肠炎暴发的流行病学调查；饮用水和娱乐用水监测；进口食品控制（尤其来自高流行地区）；食品安全控制计划中的检验（RASFF）。
需要采取哪些安全防护措施？
STEC — BSL-2 病原菌，感染剂量极低（10–100 个细胞！），须采取最高级别防护；培养物操作仅可在 II 级生物安全柜中进行；分设 PCR 前和 PCR 后区域 — 防止扩增产物污染；新生霉素 — 抗生素，避免皮肤接触；使用过的材料和培养物须先高压灭菌（121°C/30 min）再废弃；疑似 O157 时 — 考虑通报参比实验室。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 13136。