注册
LabCoda / 知识库 / 食品和饲料中的STEC（产志贺毒素大肠埃希氏菌）——增菌、stx/eae基因与血清群基因的实时荧光PCR、分离

🦠 食品和饲料中的STEC（产志贺毒素大肠埃希氏菌）——增菌、stx/eae基因与血清群基因的实时荧光PCR、分离

微生物 ISO/TS 13136

三句话速览

把样品在非选择性肉汤中增菌（含新生霉素16 mg/l的mTSB、BPW，或用于乳品的含吖啶黄12 mg/l的mTSB），提取DNA，并用实时荧光PCR检测毒力基因stx1/stx2和eae以及O157、O111、O26、O103、O145血清群的基因；由阳性样品分离菌株（如经免疫磁珠分离后接种TBX琼脂）。该检测依据 ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)；增菌：mTSB+N（新生霉素16 mg/l）——伴随微生物区系高；BPW——受胁迫细胞、冷冻品；mTSB+A（吖啶黄12 mg/l）——乳和乳制品。整个程序共 6 个步骤；主要用于：芽苗菜（第2073/2005号条例，标准1.29——STEC O157、O26、O111、O103、O145、O104:H4在25 g中不存在）、乳和乳制品（用吖啶黄的mTSB+A增菌变体）、冷冻产品和伴随微生物区系较少的产品（在BPW中增菌）。

要点速览

  • 标准: ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 6
  • 增菌: mTSB+N（新生霉素16 mg/l）——伴随微生物区系高；BPW——受胁迫细胞、冷冻品；mTSB+A（吖啶黄12 mg/l）——乳和乳制品
  • 毒力基因: stx1、stx2（变体stx2a、stx2b、stx2c）、eae（紧密黏附素）
  • 血清群基因: rfbE（O157）、wbdI（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）、wzx（O103）

概述

ISO/TS 13136:2012描述了通过检测主要毒力基因stx和eae以及与O157、O111、O26、O103和O145血清群相关的基因来鉴定产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC）——这些血清群造成了大多数重症病例，其中包括溶血性尿毒综合征（HUS）。当检出一个或两个stx基因时，即着手分离菌株；对血清群基因呈阳性的样品，可用血清群特异性的增菌技术（如免疫磁珠分离，IMS）来简化分离。检测基因的参比技术是实时荧光PCR。本技术规范适用于供人食用和动物饲养的产品，以及来自食品生产与流通环节和初级生产的环境样品。微生物学检验的通用要求由ISO 7218规定。

委员会第2073/2005号条例（欧共体）（标准1.29）要求芽苗菜在25 g中不得检出STEC O157、O26、O111、O103、O145以及O104:H4，并指明CEN/ISO TS 13136为参比方法。该方法包括五个连续的步骤：微生物增菌、核酸提取、毒力基因的检测、血清群基因的检测，以及由阳性样品进行分离（流程图见附录A；引物和探针见附录E；也可采用在琼脂糖凝胶中检测的经典PCR）。

方法原理

增菌：把称样在非选择性液体培养基中培养以增加STEC的细胞数——对伴随微生物区系含量高的基质采用含16 mg/l新生霉素的改良胰蛋白胨大豆肉汤（含1.5 g/l 3号胆盐的TSB，即mTSB）（mTSB+N），对含受胁迫细胞（如冷冻品）且伴随微生物区系较少的样品采用缓冲蛋白胨水（BPW），对乳和乳制品则采用含12 mg/l吖啶黄的mTSB（mTSB+A）；新生霉素和吖啶黄抑制革兰氏阳性细菌。标准指出，加入新生霉素是有争议的——在通常的20 mg/l浓度下（ISO 16654）它会抑制约三分之一非O157菌株的生长，故降至16 mg/l。提取：按所采用的检测系统的要求提取核酸。目标基因：stx基因（stx1和stx2；在stx2的七个变体中，目标为stx2a、stx2b和stx2c——GenBank X07865、L11078、M59432）、编码紧密黏附素（intimin）的eae基因（一种90 kDa的蛋白，负责引起重症的STEC所特有的“黏附－抹平”黏附机制），以及血清群基因：rfbE（O157）、wbdI（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）和wzx（O103）。检测：按所采用的系统进行实时荧光PCR。分离：怀疑存在STEC时即着手分离——在检出适用范围内的某一血清群后，可进行特异性增菌（如IMS）并接种胰蛋白胨－胆盐－葡萄糖醛酸苷琼脂（TBX）或特异性选择性培养基（附录F），以便于从伴随菌群中分离出STEC。

应用领域

关键参数

参数数值
增菌mTSB+N（新生霉素16 mg/l）——伴随微生物区系高；BPW——受胁迫细胞、冷冻品；mTSB+A（吖啶黄12 mg/l）——乳和乳制品
毒力基因stx1、stx2（变体stx2a、stx2b、stx2c）、eae（紧密黏附素）
血清群基因rfbE（O157）、wbdI（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）、wzx（O103）
技术实时荧光PCR（参比）；引物和探针见附录E；也可采用琼脂糖凝胶的PCR
分离检出stx后；血清群特异性IMS、TBX琼脂或选择性培养基（附录F）
结果称样中STEC检出／未检出（基因）；经确证的分离物——如在25 g芽苗菜中

标准

标准编号
ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012)
标准名称（波兰语）
Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania mikroorganizmów chorobotwórczych przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) i określania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145 (tłumaczenie robocze)
标准名称（英语）
Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

分步操作程序

  1. 肉汤的选择与增菌

    把称样（如25 g芽苗菜）在按基质选定的肉汤中均质：伴随微生物区系高时用mTSB+N（新生霉素16 mg/l），细胞受胁迫（冷冻品）时用BPW，乳和乳制品用mTSB+A（吖啶黄12 mg/l）；按标准培养。

  2. DNA提取

    按所采用的检测系统的要求从增菌培养物中提取核酸。

  3. 实时荧光PCR——毒力基因

    用附录E的引物和探针检测stx基因（stx1、stx2——变体stx2a/b/c）和eae；按所采用的系统判定结果。

  4. 实时荧光PCR——血清群基因

    在stx呈阳性的样品中检测rfbE（O157）、wbdI（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）和wzx（O103）基因。

  5. 分离

    当检出stx时：着手分离菌株；在检出适用范围内的血清群后，进行特异性增菌（如IMS）并接种TBX琼脂或特异性选择性培养基（附录F）；在分离物中确证基因。

  6. 结果

    给出称样中STEC的检出／未检出（stx/eae基因、血清群）以及分离的结果；对芽苗菜则对照第2073/2005号条例的标准（在25 g中不存在）。

所需设备与仪器

设备示例参考价格
实时荧光PCR热循环仪毒力基因和血清群基因的检测—
核酸提取试剂盒与所采用的检测系统相符—
增菌用培养箱和均质器（Stomacher）在增菌肉汤中的初始悬液—
免疫磁分离器（可选）分离时血清群特异性的IMS—
按ISO 7218配备的微生物实验室装备接种TBX、分离物的培养—

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
含新生霉素16 mg/l的mTSB（TSB + 3号胆盐1.5 g/l）—伴随微生物区系高时的增菌
缓冲蛋白胨水（BPW）—受胁迫STEC细胞的增菌与复苏
含吖啶黄12 mg/l的mTSB—乳和乳制品的增菌
PCR试剂、stx1、stx2、eae和血清群基因的引物与探针—实时荧光PCR的检测（附录E）
血清群特异性免疫磁珠、TBX琼脂—由阳性样品分离菌株

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 ISO/TS 13136:2012 (CEN ISO/TS 13136:2012) — 《Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups》。

该方法的原理是什么？

增菌：把称样在非选择性液体培养基中培养以增加STEC的细胞数——对伴随微生物区系含量高的基质采用含16 mg/l新生霉素的改良胰蛋白胨大豆肉汤（含1.5 g/l 3号胆盐的TSB，即mTSB）（mTSB+N），对含受胁迫细胞（如冷冻品）且伴随微生物区系较少的样品采用缓冲蛋白胨水（BPW），对乳和乳制品则采用含12 mg/l吖啶黄的mTSB（mTSB+A）；新生霉素和吖啶黄抑制革兰氏阳性细菌。

测量范围和准确度是多少？

增菌：mTSB+N（新生霉素16 mg/l）——伴随微生物区系高；BPW——受胁迫细胞、冷冻品；mTSB+A（吖啶黄12 mg/l）——乳和乳制品；毒力基因：stx1、stx2（变体stx2a、stx2b、stx2c）、eae（紧密黏附素）；血清群基因：rfbE（O157）、wbdI（O111）、wzx（O26）、ihp1（O145）、wzx（O103）；技术：实时荧光PCR（参比）；引物和探针见附录E；也可采用琼脂糖凝胶的PCR。

完成检测需要多长时间？

整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。

需要哪些设备？

实时荧光PCR热循环仪、核酸提取试剂盒、增菌用培养箱和均质器（Stomacher）、免疫磁分离器（可选）、按ISO 7218配备的微生物实验室装备。

该检测用于哪些场景？

芽苗菜（第2073/2005号条例，标准1.29——STEC O157、O26、O111、O103、O145、O104:H4在25 g中不存在）；乳和乳制品（用吖啶黄的mTSB+A增菌变体）；冷冻产品和伴随微生物区系较少的产品（在BPW中增菌）；来自初级生产、食品生产与流通企业的环境样品；官方检验和暴发调查——快速的PCR筛查并随后分离菌株。

需要采取哪些安全防护措施？

STEC（其中包括O157）是感染剂量低并引起HUS的病原体——在具有相应生物安全级别的实验室中工作，严格无菌操作，对培养物高压灭菌；吖啶黄和新生霉素——避免接触皮肤和吸入粉末；防止PCR扩增产物的污染——PCR前区与PCR后区分开，设阴性对照。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 ISO/TS 13136。

🔍 查找可开展此项检测的实验室