🦠 化妆品中的Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌）——在含中和剂的肉汤中增菌并在Baird-Parker琼脂上分离的检出法
三句话速览
把化妆品样品（≥ 1 g或1 ml）在含中和剂的非选择性肉汤（如含卵磷脂、聚山梨酯80和辛苯聚醇9的Eugon LT 100）中增菌，随后在含亚碲酸钾和蛋黄的选择性Baird-Parker琼脂上分离并加以鉴定（过氧化氢酶、凝固酶）；必须证明对产品抗微生物性能的中和是有效的。该检测依据 PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015)；样品：至少1 g或1 ml产品，用于在增菌肉汤中制备初始悬液。整个程序共 6 个步骤；主要用于：化妆品工业中成品和原料微生物洁净度的控制（防腐效能试验之前的检验）、用于皮肤、头发、眼睛和黏膜的化妆品以及3岁以下儿童用产品——意义重大的皮肤病原菌、生产过程卫生的评定（化妆品产品文件、GMP）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 样品: 至少1 g或1 ml产品，用于在增菌肉汤中制备初始悬液
- 增菌肉汤: Eugon LT 100（卵磷脂、聚山梨酯80、辛苯聚醇9），pH 7.0 ± 0.2，或附录A中的其他肉汤
- 选择性培养基: 含亚碲酸钾（1 %）和蛋黄乳液（约20 %）的Baird-Parker琼脂，pH 7.2 ± 0.2
概述
化妆品的微生物学检验须依据微生物风险分析进行，该分析取决于产品可能发生的变化、微生物的致病性、使用部位（头发、皮肤、眼睛、黏膜）和使用者（成人、3岁以下儿童）。检出皮肤病原菌——Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）和Candida albicans（白色念珠菌）——很重要，因为它们可能引起皮肤或眼部感染。ISO 22718:2015（第二版，ISO 22718:2006的小幅修订）给出了检出和鉴定化妆品中S. aureus的一般指南；低风险产品（水分活度低、水醇类产品、pH极端——ISO 29621）可能无需检验。该方法基于在非选择性液体培养基（增菌肉汤）中检出S. aureus，随后在选择性琼脂上分离；对某些产品（如与水不混溶的产品）可能不适宜——此时采用ISO 18415——而替代方法（如自动化方法）需要证明等效性。S. aureus是成簇排列的革兰氏阳性球菌，菌落光滑、通常有黄色色素，过氧化氢酶和凝固酶均为阳性；它是机会致病菌，可栖居于健康人的皮肤上，而在化妆品中是不受欢迎的。在波兰该标准以PN-EN ISO 22718:2016-01施行，并且是化妆品微生物洁净度检验的基本标准之一（与PN-EN ISO 21149、21150、22717、18416、18415并列）。
方法原理
第一步是在非选择性肉汤中增菌，以便在不被选择性成分抑制的情况下增加微生物的数量；第二步是在选择性培养基上分离并做鉴定试验。样品对生长可能存在的抑制必须被中和，而对产品抗微生物性能的中和是否有效须经检查并证明（标准第11章，中和剂见附录B）。增菌肉汤Eugon LT 100含有中和成分——卵磷脂和聚山梨酯80——以及分散剂辛苯聚醇9（每1 l的组成：酪蛋白水解物15 g、大豆水解物5 g、L-胱氨酸0.7 g、NaCl 4 g、亚硫酸钠0.2 g、葡萄糖5.5 g、蛋黄卵磷脂1 g、聚山梨酯80 5 g、辛苯聚醇9 1 g；pH 7.0 ± 0.2；121 °C灭菌15 min）；在证明适用性后也允许使用其他肉汤（附录A）。选择性Baird-Parker琼脂：基础培养基（酪蛋白水解物10 g、酵母浸膏1 g、肉浸膏5 g、丙酮酸钠10 g、L-甘氨酸12 g、氯化锂5 g、琼脂12–22 g、水至950 ml；pH 7.2 ± 0.2）加亚碲酸钾溶液（1 g/100 ml，经0.22 µm过滤除菌，在(3 ± 2) °C下至多保存一个月）和蛋黄乳液（约20 %）。适用性试验使用胰蛋白胨氯化钠稀释液（胰蛋白胨1 g、NaCl 8.5 g/l；pH 7.0 ± 0.2）和TSA/SCDA琼脂（pH 7.3 ± 0.2）；一般指南见ISO 21148，试验菌株见EN 12353。水：蒸馏水或按ISO 21148净化的水。
应用领域
- 化妆品工业中成品和原料微生物洁净度的控制（防腐效能试验之前的检验）
- 用于皮肤、头发、眼睛和黏膜的化妆品以及3岁以下儿童用产品——意义重大的皮肤病原菌
- 生产过程卫生的评定（化妆品产品文件、GMP）
- 投诉检验和批次放行；防腐剂中和的验证
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 样品 | 至少1 g或1 ml产品，用于在增菌肉汤中制备初始悬液 |
| 增菌肉汤 | Eugon LT 100（卵磷脂、聚山梨酯80、辛苯聚醇9），pH 7.0 ± 0.2，或附录A中的其他肉汤 |
| 选择性培养基 | 含亚碲酸钾（1 %）和蛋黄乳液（约20 %）的Baird-Parker琼脂，pH 7.2 ± 0.2 |
| 鉴定 | 在选择性培养基上生长，过氧化氢酶 +，凝固酶 + |
| 中和 | 必须证明中和有效（第11章）；中和剂——附录B |
| 培养基灭菌 | 高压灭菌器121 °C，15 min；亚碲酸盐——0.22 µm过滤 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015)
- 标准名称（波兰语）
- Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus
- 标准名称（英语）
- Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus
分步操作程序
-
风险分析与样品
根据风险分析（ISO 29621）确定产品是否需要检验；取至少1 g或1 ml产品作为制备初始悬液的样品。
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初始悬液与增菌
把样品分散在规定体积的含中和剂的增菌肉汤中（Eugon LT 100或其他已证明适用的肉汤）；必要时制备稀释液；培养该肉汤（标准第9.3条）。
-
分离
从增菌培养物接种Baird-Parker琼脂（或附录A中的其他培养基）并培养；也允许转接到非选择性培养基后用试剂盒鉴定。
-
鉴定
在选择性培养基上形态特征性的菌落用过氧化氢酶试验和凝固酶试验确证（S. aureus：两者均为阳性）；有疑问时使用鉴定试剂盒。
-
适用性试验（中和）
平行证明产品不抑制生长：在胰蛋白胨氯化钠稀释液中制备S. aureus接种物，加入带肉汤的样品中，并与TSA上的对照比较回收率（第11.3条）；未确证中和时阴性结果无效。
-
结果与报告
给出受检产品量中S. aureus的存在或不存在、所用的肉汤和培养基、中和的方式以及适用性试验的结果（第10章和第12章）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 高压灭菌器和培养箱 | 肉汤和Baird-Parker平板的培养 | — |
| 0.22 µm滤膜 | 亚碲酸钾溶液的除菌 | — |
| 培养皿、烧瓶、移液管、接种环 | 分离和鉴定试验 | — |
| 均质器或振荡器 | 在含辛苯聚醇9的肉汤中分散样品 | — |
| 鉴定试剂盒（可选） | 转接到非选择性培养基后进行鉴定 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Eugon LT 100肉汤（含卵磷脂、聚山梨酯80和辛苯聚醇9） | — | 带防腐剂中和的非选择性增菌 |
| Baird-Parker琼脂——基础培养基 + 1 %亚碲酸钾 + 蛋黄乳液 | — | S. aureus的选择性分离 |
| 胰蛋白胨氯化钠溶液（胰蛋白胨1 g、NaCl 8.5 g/l） | — | 方法适用性试验用的菌悬液 |
| 大豆酪蛋白琼脂（TSA/SCDA） | — | 适用性试验（第11章）和对照菌株的培养 |
| 新鲜鸡蛋、70 %乙醇 | — | 无市售制品时自制蛋黄乳液（蛋壳用70 %乙醇消毒30 s） |
| S. aureus试验菌株（按EN 12353保存） | — | 中和和培养基的对照 |
职业健康与安全
- S. aureus是机会致病菌（皮肤和眼部感染）——在微生物实验室条件下操作，对培养物去污染
- 亚碲酸钾有毒——称量和配制溶液时戴手套，避免扬尘
- 蛋黄乳液——制备时注意无菌和卫生（蛋壳消毒）
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 22718:2016-01 (ISO 22718:2015) — 《Cosmetics — Microbiology — Detection of Staphylococcus aureus》。
该方法的原理是什么？
第一步是在非选择性肉汤中增菌，以便在不被选择性成分抑制的情况下增加微生物的数量；第二步是在选择性培养基上分离并做鉴定试验。样品对生长可能存在的抑制必须被中和，而对产品抗微生物性能的中和是否有效须经检查并证明（标准第11章，中和剂见附录B）。
测量范围和准确度是多少？
样品：至少1 g或1 ml产品，用于在增菌肉汤中制备初始悬液；增菌肉汤：Eugon LT 100（卵磷脂、聚山梨酯80、辛苯聚醇9），pH 7.0 ± 0.2，或附录A中的其他肉汤；选择性培养基：含亚碲酸钾（1 %）和蛋黄乳液（约20 %）的Baird-Parker琼脂，pH 7.2 ± 0.2；鉴定：在选择性培养基上生长，过氧化氢酶 +，凝固酶 +。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
高压灭菌器和培养箱、0.22 µm滤膜、培养皿、烧瓶、移液管、接种环、均质器或振荡器、鉴定试剂盒（可选）。
该检测用于哪些场景？
化妆品工业中成品和原料微生物洁净度的控制（防腐效能试验之前的检验）；用于皮肤、头发、眼睛和黏膜的化妆品以及3岁以下儿童用产品——意义重大的皮肤病原菌；生产过程卫生的评定（化妆品产品文件、GMP）；投诉检验和批次放行；防腐剂中和的验证。
需要采取哪些安全防护措施？
S. aureus是机会致病菌（皮肤和眼部感染）——在微生物实验室条件下操作，对培养物去污染；亚碲酸钾有毒——称量和配制溶液时戴手套，避免扬尘；蛋黄乳液——制备时注意无菌和卫生（蛋壳消毒）。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 22718。