🍎 油脂的脂肪酸组成——脂肪酸甲酯（FAME），气相色谱GC-FID
三句话速览
将脂肪酸（游离的以及结合在酰基甘油中的）转化为甲酯（按ISO 12966-2或-3），在毛细管柱上分离（10～100 m，测定顺反异构体用极性氰烷基聚硅氧烷固定相），以氢火焰离子化检测器检测；各组分含量由峰面积（归一化法）或用内标法计算。该检测依据 PN-EN ISO 12966-1:2015-01；脂肪酸范围：C4至C26的FAME：饱和、顺式与反式单烯以及多烯脂肪酸。整个程序共 8 个步骤（合计约 1 分钟）；主要用于：植物油与动物脂肪的表征与鉴别（脂肪酸谱、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸）、测定氢化油脂与煎炸油脂中的反式异构体与共轭异构体、从基质中提取脂肪后的食品营养声称。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 12966-1:2015-01
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 1 分钟
- 脂肪酸范围: C4至C26的FAME：饱和、顺式与反式单烯以及多烯脂肪酸
- 色谱柱: WCOT毛细管柱10～100 m，内径0.1～0.53 mm，膜厚0.1～0.3 µm；分流/不分流进样用0.20～0.32 mm，直接进样用0.53 mm
- 顺反异构体用固定相: 100 m，0.20～0.25 mm，膜厚0.20 µm，双氰丙基（SP-2560）或氰丙基（CP-Sil 88）
概述
ISO 12966标准的第1部分概述了将动植物油脂中游离与结合的脂肪酸转化为甲酯（FAME）后进行色谱测定的方法。用气相色谱定量与定性测定脂肪酸组成在脂质分析中应用广泛——用于表征油脂以及从基质中提取脂肪后的含脂食品。ISO 12966系列（第1～4部分）已取代ISO 5508、ISO 5509与ISO 15304；它适用于粗制、精炼、部分与完全氢化的油脂以及脂肪酸，但不适用于乳脂与反刍动物脂肪、富含共轭亚油酸（CLA）的产品以及聚合与氧化的油脂。甲酯的制备见第2部分（化学方法）与第3部分（三甲基氢氧化锍，TMSH），毛细管分析条件见第4部分。
甲酯中羧基被封闭，无法形成氢键，从而使沸点与熔点低于相应脂肪酸，使气相色谱分析成为可能。标准汇总了各种酯化方法：甲醇KOH快速酯交换（不酯化游离脂肪酸；也适用于含短链脂肪酸的油脂，有生成皂的风险）、NaOCH3通用酯交换/甲酯化（不推荐用于月桂型油脂）、BF3甲酯化（14 %甲醇溶液，需外购，毒性很大；适用于鱼油）、甲醇H2SO4或HCl（适用于游离脂肪酸含量较高的样品；密闭安瓿中3 h）以及TMSH（速度很快，C4～C26，游离脂肪酸酯化率约80 %，产生少量反式异构体）。
分离采用内径0.1～0.53 mm、膜厚0.1～0.3 µm的WCOT毛细管柱，柱长依所需分离度为10～100 m；柱长加倍仅使分离度提高1.41倍。对于多不饱和脂肪酸几何异构体与位置异构体的复杂混合物，推荐使用带双氰丙基固定相（SP-2560）或高取代氰丙基固定相（CP-Sil 88）的100 m色谱柱。使用FID时载气宜为氢气（使用质谱检测器时为氦气）。在格但斯克大学的实验指导书中，猪脂FAME分析在RTX-5 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm柱上、以120～220 °C程序升温进行。
方法原理
将按ISO 12966-2或ISO 12966-3制备的甲酯（例如以甲醇KOH溶液对脂肪的异辛烷溶液进行酯交换，随后用硫酸氢钠中和）溶于溶剂后注入进样口并气化；分离在选定极性与长度的毛细管柱上进行，各组分以特征保留时间流出色谱柱，并与FAME标准混合物的保留时间比对。检测：氢火焰离子化检测器（FID）。各脂肪酸的百分含量由峰面积按内归一化法计算（峰面积占总和的百分比），或用内标法或响应校正因子更精确地计算。使用质谱检测器时应考虑各FAME碎裂行为的差异。
应用领域
- 植物油与动物脂肪的表征与鉴别（脂肪酸谱、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸）
- 测定氢化油脂与煎炸油脂中的反式异构体与共轭异构体
- 从基质中提取脂肪后的食品营养声称
- 油脂（例如橄榄油）掺伪的检出与规格符合性控制
- 由脂肪酸组成计算碘值（ISO 3961附录B）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 脂肪酸范围 | C4至C26的FAME：饱和、顺式与反式单烯以及多烯脂肪酸 |
| 色谱柱 | WCOT毛细管柱10～100 m，内径0.1～0.53 mm，膜厚0.1～0.3 µm；分流/不分流进样用0.20～0.32 mm，直接进样用0.53 mm |
| 顺反异构体用固定相 | 100 m，0.20～0.25 mm，膜厚0.20 µm，双氰丙基（SP-2560）或氰丙基（CP-Sil 88） |
| 载气 | 使用FID时为氢气（分离更快、峰形更锐）；使用质谱检测器时为氦气 |
| 示例条件（格但斯克大学，猪脂） | RTX-5 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm，进样口与检测器300 °C，120→220 °C以3 °C/min升温，氩气1.5 ml/min，进样1 µl |
| 计算 | 内归一化法（面积%）或内标法/校正因子 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 12966-1:2015-01
- 标准名称（波兰语）
- Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 1: Przewodnik do nowoczesnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych
- 标准名称（英语）
- Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 1: Guidelines on modern gas chromatography of fatty acid methyl esters
分步操作程序
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酯化方法的选择
按标准表1选择方法：KOH/甲醇（快速，不酯化游离脂肪酸）、NaOCH3（不适用于月桂型油脂）、BF3（鱼油）、甲醇H2SO4/HCl（游离脂肪酸含量高，安瓿中3 h）或TMSH（极快速，仅限分流进样）。
-
FAME的制备（格但斯克大学示例，KOH）
向带刻度试管中加入1 ml脂肪的异辛烷溶液（10 mg/ml），加入3 ml异辛烷并振摇；加入400 µl甲醇KOH溶液并剧烈振摇约30 s——出现浑浊后甘油析出，混合液变澄清。
-
中和
加入约1 g硫酸氢钠并振摇；待盐沉降后用移液管将含甲酯的上层移入1.5 ml样品瓶。
-
色谱条件
安装适合目的的色谱柱（测定异构体用100 m极性柱；实验课用RTX-5 30 m），设定进样口与检测器（例如300 °C）、升温程序（例如120→220 °C，3 °C/min）与载气（FID用氢气；格但斯克大学用氩气1.5 ml/min）。
-
标准分析
注入1 µl FAME标准混合物并确定各甲酯的保留时间；使用100 m极性柱时应参考ISO 12966-4的洗脱顺序。
-
样品分析
在相同条件下注入1 µl样品FAME溶液；通过比对保留时间鉴别色谱峰。
-
计算
按内归一化法由峰面积计算各脂肪酸的百分含量（占面积总和的百分比），或采用内标法/校正因子；结果可换算为每克产品的毫克数。
-
检验报告
给出酯化方法（标准的相应部分）、色谱柱与色谱条件、计算方式以及脂肪酸组成。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 带FID的气相色谱仪 | 分流/不分流、柱上或直接进样口；例如Shimadzu GC-2025（格但斯克大学指导书） | — |
| 毛细管柱 | 测定异构体用100 m极性氰丙基柱（SP-2560、CP-Sil 88）；格但斯克大学实验课用非极性RTX-5 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm | — |
| 载气源 | 氢气（发生器或钢瓶）或氦气；以及FID所用气体 | — |
| 微量注射器或自动进样器 | 10 µl气相色谱注射器，进样1 µl | — |
| 酯化用玻璃器皿 | 带塞刻度试管、1.5 ml样品瓶、移液管；酸法所用安瓿 | — |
| FAME标准混合物 | 用于确定保留时间与鉴别色谱峰 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 氢氧化钾的甲醇溶液 | 1310-58-3 | 快速碱性酯交换（ISO 12966-2，4.2）；格但斯克大学指导书：每1 ml 10 mg/ml猪脂异辛烷溶液用400 µl |
| 甲醇 | 67-56-1 | 甲酯化试剂（KOH、NaOCH3、BF3、H2SO4、HCl）的溶剂 |
| 三氟化硼，14 %甲醇溶液 | 7637-07-2 | 外购，因毒性不自行配制；保存期有限；适用于鱼油，不适用于含仲位含氧基团的化合物 |
| 三甲基氢氧化锍（TMSH） | — | 现成溶液；C4～C26的极快速方法，仅限分流进样；副产物峰接近短链FAME |
| 异辛烷 | 540-84-1 | 酯化用脂肪试样的溶剂（格但斯克大学指导书） |
| 硫酸氢钠 | — | 酯交换后用于中和KOH（约1 g），格但斯克大学指导书 |
职业健康与安全
- 甲醇中的三氟化硼毒性很大——只能在密闭小瓶中并在通风橱内操作
- 甲醇的KOH与酸溶液具有腐蚀性，甲醇有毒——护目镜、手套、通风橱
- 以氢气作载气——检查管路气密性，配备检漏仪；异辛烷易燃
- 进样口与检测器高温（300 °C）——运行中不得触碰
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 12966-1:2015-01 — 《Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 1: Guidelines on modern gas chromatography of fatty acid methyl esters》。
该方法的原理是什么？
将按ISO 12966-2或ISO 12966-3制备的甲酯（例如以甲醇KOH溶液对脂肪的异辛烷溶液进行酯交换，随后用硫酸氢钠中和）溶于溶剂后注入进样口并气化；分离在选定极性与长度的毛细管柱上进行，各组分以特征保留时间流出色谱柱，并与FAME标准混合物的保留时间比对。检测：氢火焰离子化检测器（FID）。
测量范围和准确度是多少？
脂肪酸范围：C4至C26的FAME：饱和、顺式与反式单烯以及多烯脂肪酸；色谱柱：WCOT毛细管柱10～100 m，内径0.1～0.53 mm，膜厚0.1～0.3 µm；分流/不分流进样用0.20～0.32 mm，直接进样用0.53 mm；顺反异构体用固定相：100 m，0.20～0.25 mm，膜厚0.20 µm，双氰丙基（SP-2560）或氰丙基（CP-Sil 88）；载气：使用FID时为氢气（分离更快、峰形更锐）；使用质谱检测器时为氦气。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
带FID的气相色谱仪、毛细管柱、载气源、微量注射器或自动进样器、酯化用玻璃器皿、FAME标准混合物。
该检测用于哪些场景？
植物油与动物脂肪的表征与鉴别（脂肪酸谱、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸）；测定氢化油脂与煎炸油脂中的反式异构体与共轭异构体；从基质中提取脂肪后的食品营养声称；油脂（例如橄榄油）掺伪的检出与规格符合性控制；由脂肪酸组成计算碘值（ISO 3961附录B）。
需要采取哪些安全防护措施？
甲醇中的三氟化硼毒性很大——只能在密闭小瓶中并在通风橱内操作；甲醇的KOH与酸溶液具有腐蚀性，甲醇有毒——护目镜、手套、通风橱；以氢气作载气——检查管路气密性，配备检漏仪；异辛烷易燃；进样口与检测器高温（300 °C）——运行中不得触碰。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 12966-1。