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🦠 水中的Salmonella spp.（沙门氏菌）——缓冲蛋白胨水BPW预增菌、选择性增菌（RVS、MKTTn）并在XLD琼脂上划线分离的检出法

微生物 PN-EN ISO 19250

三句话速览

把水样（至多10 ml可直接取用，更大体积——甚至1000–5000 ml——经0。该检测依据 PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010)；样品体积：< 10 ml直接加入50 ml BPW；> 10 ml经0.45 µm滤膜过滤后加入50 ml BPW；饮用水1000–5000 ml。整个程序共 7 个步骤；主要用于：饮用水和地下水——1000–5000 ml的大体积经膜过滤浓缩、受污染的地表水和污水（体积较小；污水采用较短的预增菌或直接接种）、流行病学调查和暴发调查（使用附加培养基；注意S. Typhi和S. Paratyphi）。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010)
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 7
  • 样品体积: < 10 ml直接加入50 ml BPW；> 10 ml经0.45 µm滤膜过滤后加入50 ml BPW；饮用水1000–5000 ml
  • 预增菌: BPW，(36 ± 2) °C，(18 ± 2) h
  • 选择性增菌: RVS 0.1 ml/10 ml，(41.5 ± 1.0) °C，(24 ± 3) h［最高42.5 °C］，可选延至(48 ± 4) h；MKTTn 1 ml/10 ml，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h

概述

ISO 19250:2010规定了在水样中检出Salmonella spp.（推定的或确证的）的方法；出于流行病学目的或在暴发调查中可能需要附加的培养基。标准提醒，该方法可能无法回收所有Salmonella ser. Typhi和ser. Paratyphi菌株。采用适当的样品体积作MPN试验可实现半定量——此时应调整缓冲蛋白胨水的体积。检出需要四个连续的阶段：预增菌（可检出数量很少或受损伤的Salmonella细胞；某些菌株需要更长的培养时间）、选择性增菌（Salmonella数量很少，而伴随的其他Enterobacteriaceae数量多得多）、在固体培养基上划线分离，以及识别与确证。对于污水，较短的预增菌或直接接种到选择性培养基中可得到更好的结果。

饮用水的典型体积为1000–5000 ml，经膜过滤浓缩；受污染的地表水和污水——体积较小。在环境温度下存放的样品应在采样后12 h内检验；特殊情况下允许于(5 ± 3) °C保存至多24 h。在波兰它以PN-EN ISO 19250:2013-07（波兰文版，出版日期20-09-2022）施行。国内的培养基供应商为该标准提供成套产品：缓冲蛋白胨水、RVS肉汤、MKTTn肉汤、XLD琼脂以及用于血清学确证的诊断血清（菌体O抗原和Vi抗原）。

方法原理

预增菌：在环境温度下用已知体积的样品或其稀释液接种缓冲蛋白胨水（BPW），并在(36 ± 2) °C下培养(18 ± 2) h——低于10 ml的体积加入50 ml BPW中；高于10 ml的体积经孔径0.45 µm的无菌滤膜过滤，把滤膜浸入50 ml BPW中（对浑浊的水使用助滤剂，通常在衬垫上放15 ml，另15 ml与样品混合；BPW最终体积为100 ml）；培养物也可分装成MPN系列。选择性增菌：把0.1 ml培养物移入10 ml含大豆的Rappaport-Vassiliadis肉汤（RVS）中，在(41.5 ± 1.0) °C下培养(24 ± 3) h（不得超过42.5 °C），必要时为检出生长缓慢的菌株可再培养(24 ± 3) h，总计(48 ± 4) h；同时把1 ml移入10 ml含新生霉素的Müller-Kauffmann四硫磺酸盐肉汤（MKTTn）中，在(36 ± 2) °C下培养(24 ± 3) h（MKTTn可回收大多数菌株，包括部分S. Paratyphi，但不包括S. Paratyphi C；当在亚硒酸盐胱氨酸肉汤之后怀疑为S. Typhi时不使用它）。划线分离：从每一份选择性培养物接种木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD），倒置于(36 ± 2) °C培养，(24 ± 3) h后观察有无推定的Salmonella菌落，同时接种与XLD互补的第二种固体选择性培养基，必要时选用适于乳糖阳性菌株、S. Typhi和S. Paratyphi的培养基（如亮绿琼脂、亚硫酸铋琼脂），按制造商的建议培养。确证：把推定菌落转接后，用适当的生化和血清学试验加以确证。

应用领域

关键参数

参数数值
样品体积< 10 ml直接加入50 ml BPW；> 10 ml经0.45 µm滤膜过滤后加入50 ml BPW；饮用水1000–5000 ml
预增菌BPW，(36 ± 2) °C，(18 ± 2) h
选择性增菌RVS 0.1 ml/10 ml，(41.5 ± 1.0) °C，(24 ± 3) h［最高42.5 °C］，可选延至(48 ± 4) h；MKTTn 1 ml/10 ml，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h
划线分离XLD琼脂，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h + 按制造商要求的第二种选择性培养基（BGA、亚硫酸铋琼脂）
确证生化和血清学试验（O抗原、Vi抗原）
样品保存在环境温度下12 h内检验；特殊情况下于(5 ± 3) °C保存至多24 h

标准

标准编号
PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010)
标准名称（波兰语）
Jakość wody — Wykrywanie Salmonella spp.
标准名称（英语）
Water quality — Detection of Salmonella spp.

分步操作程序

  1. 采样与保存

    采样后在12 h内开始检验（环境温度）；特殊情况下于(5 ± 3) °C保存至多24 h。选择体积：饮用水1000–5000 ml，受污染的水和污水——较少。

  2. 预增菌——体积 < 10 ml

    在环境温度下用样品或其稀释液接种50 ml BPW，并在(36 ± 2) °C下培养(18 ± 2) h。

  3. 预增菌——体积 > 10 ml

    把样品经0.45 µm无菌滤膜过滤（浑浊水：衬垫上约15 ml助滤剂，另15 ml与样品混合），把滤膜浸入50 ml BPW中（最终为100 ml BPW），并在(36 ± 2) °C下培养(18 ± 2) h；作MPN时分装成一系列试管。

  4. 选择性增菌

    把0.1 ml培养物移入10 ml RVS肉汤，在(41.5 ± 1.0) °C下培养(24 ± 3) h（不得超过42.5 °C；必要时延长至总计(48 ± 4) h）。同时把1 ml移入10 ml MKTTn，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h。

  5. 在固体培养基上划线分离

    从每一份选择性培养物接种XLD琼脂和第二种选择性培养基；XLD倒置于(36 ± 2) °C培养，(24 ± 3) h后观察，第二种培养基——按制造商的建议。标出推定的Salmonella菌落。

  6. 确证

    把推定菌落转接（按第5步重复接种；在(36 ± 2) °C下(24 ± 3) h），并用生化试验以及血清学试验（O抗原、Vi抗原）加以确证。

  7. 结果

    报告在所检验的水体积中有无Salmonella spp.（推定的或确证的）；作MPN系列时——报告MPN数。

所需设备与仪器

设备示例参考价格
高压灭菌器(121 ± 3) °C和(115 ± 3) °C培养基灭菌—
水浴或培养箱(36 ± 2) °C和(41.5 ± 1.0) °C预增菌、MKTTn、XLD／RVS肉汤—
水浴(70 ± 1) °C和50–55 °C制备培养基—
配0.45 µm无菌滤膜的膜过滤装置浓缩 > 10 ml的体积；浑浊水用助滤剂—
在20–25 °C下校准准确度为 ± 0.1 pH的pH计培养基pH的控制—
培养皿、试管、无菌移液管、接种环接种和转接—

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
缓冲蛋白胨水（BPW）—非选择性预增菌（复苏受损伤的细胞）
含大豆的Rappaport-Vassiliadis肉汤（RVS）—在41.5 °C下选择性增菌
含新生霉素的Müller-Kauffmann四硫磺酸盐肉汤（MKTTn）—在36 °C下的第二种选择性增菌
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）—分离划线——推定的Salmonella菌落
第二种选择性培养基（如亮绿琼脂、亚硫酸铋琼脂）—与XLD互补，也适用于乳糖阳性菌株、S. Typhi、S. Paratyphi
诊断血清（菌体O抗原和Vi抗原）和生化试验—推定菌落的确证

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 19250:2013-07 (ISO 19250:2010) — 《Water quality — Detection of Salmonella spp.》。

该方法的原理是什么？

预增菌：在环境温度下用已知体积的样品或其稀释液接种缓冲蛋白胨水（BPW），并在(36 ± 2) °C下培养(18 ± 2) h——低于10 ml的体积加入50 ml BPW中；高于10 ml的体积经孔径0.45 µm的无菌滤膜过滤，把滤膜浸入50 ml BPW中（对浑浊的水使用助滤剂，通常在衬垫上放15 ml，另15 ml与样品混合；BPW最终体积为100 ml）；培养物也可分装成MPN系列。

测量范围和准确度是多少？

样品体积：< 10 ml直接加入50 ml BPW；> 10 ml经0.45 µm滤膜过滤后加入50 ml BPW；饮用水1000–5000 ml；预增菌：BPW，(36 ± 2) °C，(18 ± 2) h；选择性增菌：RVS 0.1 ml/10 ml，(41.5 ± 1.0) °C，(24 ± 3) h［最高42.5 °C］，可选延至(48 ± 4) h；MKTTn 1 ml/10 ml，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h；划线分离：XLD琼脂，(36 ± 2) °C，(24 ± 3) h + 按制造商要求的第二种选择性培养基（BGA、亚硫酸铋琼脂）。

完成检测需要多长时间？

整个程序共 7 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。

需要哪些设备？

高压灭菌器(121 ± 3) °C和(115 ± 3) °C、水浴或培养箱(36 ± 2) °C和(41.5 ± 1.0) °C、水浴(70 ± 1) °C和50–55 °C、配0.45 µm无菌滤膜的膜过滤装置、在20–25 °C下校准准确度为 ± 0.1 pH的pH计、培养皿、试管、无菌移液管、接种环。

该检测用于哪些场景？

饮用水和地下水——1000–5000 ml的大体积经膜过滤浓缩；受污染的地表水和污水（体积较小；污水采用较短的预增菌或直接接种）；流行病学调查和暴发调查（使用附加培养基；注意S. Typhi和S. Paratyphi）；用一系列样品体积作Salmonella的半定量MPN测定；自来水和卫生实验室对净化与处理效果的控制。

需要采取哪些安全防护措施？

Salmonella spp.是肠道致病菌（包括S. Typhi）——应在微生物实验室条件下工作，所有培养物均须消毒和高压灭菌；41.5 °C的RVS肉汤和高压灭菌后的培养基——有烫伤风险；在真空下过滤大体积——玻璃器具须完好，移取滤膜时须无菌操作。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 19250。

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