🦠 沙门氏菌属检出
检出食品和饲料中沙门氏菌的经典培养法。四阶段流程：预增菌 → 选择性增菌 → 选择性平板划线 → 确证。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 6579-1:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 12
- 各步骤合计时间: 4 天 18 小时 7 分钟
- 结果: 25 g 中检出 / 未检出（定性）
- 取样量: 25 g（或按标准规定）
- 出结果时间: 4–5 个工作日
概述
沙门氏菌是肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌属，也是全球最重要的食源性病原菌之一。它引起沙门氏菌病 — 表现为腹泻、发热和腹痛。最常见的血清型为肠炎沙门氏菌（蛋、禽肉）和鼠伤寒沙门氏菌（肉类、蔬菜）。
PN-EN ISO 6579-1 标准是检出食品、饲料及食品生产车间环境样品中沙门氏菌的"金标准"。该方法为水平法 — 适用于所有类型的食品和饲料。（EC）2073/2005 号法规（微生物标准）和国家监测计划均要求采用该方法。
判据：对大多数即食产品、肉类、蛋类和婴幼儿食品，沙门氏菌 — 25 g 中不得检出。食品中检出沙门氏菌将导致该批产品从市场召回。
方法原理
基于经典培养的四阶段法：
1. **预增菌** — 样品在缓冲蛋白胨水（BPW）中，37°C 培养 18 h。使受损细胞复苏。 2. **选择性增菌** — 接种至 RVS（Rappaport-Vassiliadis）41,5°C/24 h 和 MKTTn（含四硫磺酸盐的 Müller-Kauffmann）37°C/24 h。选择性抑制竞争菌群。 3. **选择性鉴别培养基划线** — XLD 琼脂 + 第二种培养基（BGA、显色培养基）。典型菌落：XLD 上中心发黑（产 H₂S）。 4. **生化和血清学确证** — TSI、LDC、尿素、吲哚、VP，以及与抗血清的凝集反应。
应用领域
- 即食食品控制（2073/2005 号法规）
- 禽肉、猪肉和牛肉检验
- 蛋和蛋制品控制
- 蔬菜、水果和芽苗检验
- 食品生产车间环境监测（涂抹样）
- 饲料和饲料原料检验
- 水和环境检验（方法调整后适用）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | 25 g 中检出 / 未检出（定性） |
| 取样量 | 25 g（或按标准规定） |
| 出结果时间 | 4–5 个工作日 |
| 检出限 | 1 个细胞 / 25 g（理论值） |
| 培养温度 | 37°C（BPW、MKTTn）、41,5°C（RVS） |
| 特异性 | 对沙门氏菌属 >98% |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 6579-1:2017
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella — Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
分步操作程序
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样品制备
称取 25 g 样品于均质袋中。加入 225 mL 缓冲蛋白胨水（BPW）。比例 1:10。
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均质
在拍击式均质器中均质 1–2 分钟（强度视基质而定：肉类 — 时间长，乳品 — 时间短）。
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预增菌
将装有 BPW 样品的袋在 37±1°C 培养 18±2 小时。目的：使受损的沙门氏菌细胞复苏。
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选择性增菌 — RVS
取 0,1 mL 预增菌液转入 10 mL RVS 肉汤。在 41,5±1°C 培养 24±3 小时。
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选择性增菌 — MKTTn
取 1 mL 预增菌液转入 10 mL MKTTn 肉汤。在 37±1°C 培养 24±3 小时。
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固体培养基划线
从两种肉汤分别用接种环划线接种 XLD 琼脂和第二种培养基（BGA 或显色培养基）。37°C 培养 24±3 h。
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菌落读取
XLD 上：典型菌落 — 粉红至红色、中心发黑（H₂S+）或无黑心（H₂S–）。BGA 上：粉红至红色并被红色圈围绕。
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分离纯培养物
从每种培养基挑取至少 5 个可疑菌落。传代至营养琼脂。37°C 培养 24 h。
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生化确证
TSI：斜面碱性（K）/底层酸性（A），产气 +，H₂S +/–。尿素：阴性。LDC：阳性。吲哚：阴性（通常）。VP：阴性。
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血清学确证
用多价 O 和 H 抗血清做玻片凝集。1 分钟内出现凝集即为阳性。
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结果判读
经生化和血清学确证的菌落 = 25 g 中检出沙门氏菌。无典型菌落或确证为阴性 = 未检出。
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报告
结果："25 g 中检出 / 未检出沙门氏菌属"。可选：血清型分型（肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱 37±1°C | Memmert IN110、Binder BD 115、POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| 培养箱 / 水浴 41,5±1°C | Memmert WNB 14、GFL 1003 水浴 | 3 000–10 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator、BagMixer 400 | 12 000–25 000 PLN |
| 高压灭菌器 | Tuttnauer 3870ELV、Systec VX-75 | 30 000–80 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | ESCO Airstream、Thermo MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
| 移液器 | Eppendorf Research Plus 1 mL + 10 mL | 800–2 000 PLN / 支 |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 500、BZG 30 | 3 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | 混合物 | 每升含蛋白胨 10 g + NaCl 5 g + Na₂HPO₄ 3,5 g + KH₂PO₄ 1,5 g。Merck 1.07228、Oxoid CM0509 |
| RVS 肉汤（Rappaport-Vassiliadis） | — | 含孔雀绿和 MgCl₂ 的选择性肉汤。Merck 1.07700、Oxoid CM0669。41,5°C 培养。 |
| MKTTn 肉汤（Müller-Kauffmann） | — | 含四硫磺酸盐、牛胆盐和新生霉素。Merck 1.05878。37°C 培养。 |
| XLD 琼脂（木糖赖氨酸脱氧胆酸盐） | — | 沙门氏菌菌落：红色、中心发黑（H₂S+）。Merck 1.05287、Oxoid CM0469。 |
| BGA 琼脂（亮绿琼脂） | — | 第二种选择性培养基。沙门氏菌菌落：粉红至红色。Oxoid CM0329。 |
| 营养琼脂 | — | 非选择性培养基，用于分离纯培养物。 |
| TSI 培养基（三糖铁） | — | 确证：K/A 并产 H₂S（斜面碱性、底层酸性、黑色沉淀） |
| 尿素培养基（Christensen） | — | 沙门氏菌 — 阴性（不水解尿素，不变色） |
| 赖氨酸脱羧酶肉汤（LDC） | — | 沙门氏菌 — 阳性（呈紫色） |
| 沙门氏菌多价 O 和 H 抗血清 | — | bioMérieux、Denka Seiken — 用于玻片凝集 |
职业健康与安全
- 沙门氏菌 — BSL-2 病原菌！只能在 II 级生物安全柜中操作
- 必须佩戴丁腈手套、实验服和护目镜
- 所有废物须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
- 作业结束后对台面消毒（70% 乙醇或含氯溶液）
- 阳性结果须报告卫生监督部门 — 系法定义务
培训与视频资料
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 6579-1:2017 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.》。
该方法的原理是什么？
基于经典培养的四阶段法： 1. **预增菌** — 样品在缓冲蛋白胨水（BPW）中，37°C 培养 18 h。
测量范围和准确度是多少？
结果：25 g 中检出 / 未检出（定性）；取样量：25 g（或按标准规定）；出结果时间：4–5 个工作日；检出限：1 个细胞 / 25 g（理论值）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 4 天 18 小时 7 分钟。整个程序共 12 个步骤。
需要哪些设备？
培养箱 37±1°C、培养箱 / 水浴 41,5±1°C、拍击式均质器、高压灭菌器、II 级生物安全柜、移液器、菌落计数器。核心仪器的参考价格（培养箱 37±1°C）：5 000–15 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
即食食品控制（2073/2005 号法规）；禽肉、猪肉和牛肉检验；蛋和蛋制品控制；蔬菜、水果和芽苗检验；食品生产车间环境监测（涂抹样）；饲料和饲料原料检验；水和环境检验（方法调整后适用）。
需要采取哪些安全防护措施？
沙门氏菌 — BSL-2 病原菌！只能在 II 级生物安全柜中操作；必须佩戴丁腈手套、实验服和护目镜；所有废物须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃；作业结束后对台面消毒（70% 乙醇或含氯溶液）；阳性结果须报告卫生监督部门 — 系法定义务。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 6579-1。