🦠 肉与肉制品中的推定Pseudomonas spp.（假单胞菌属）——CFC琼脂表面涂布法（25 °C，44 h）
三句话速览
取0.1 ml初始悬液和十倍系列稀释液，用涂布棒涂布于CFC琼脂（基础培养基加头孢噻吩50 µg/ml、夫西地酸钠10 µg/ml和西曲溴铵10 µg/ml）表面，在25 °C ± 1 °C下培养44 h ± 4 h，并用氧化酶试验（阳性）确证菌落；结果以每g或每ml的推定Pseudomonas spp。该检测依据 PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010)；培养：25 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h。整个程序共 6 个步骤；主要用于：肉与肉制品，包括禽肉制品——推定Pseudomonas spp.的计数（标准的适用范围）、按制造商说明的CFC培养基：从肉与肉制品、乳制品、水和环境样品中分离Pseudomonas spp.、检验肉类原料的企业实验室和官方实验室——商品培养基（基础培养基 + CFC添加剂）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 培养: 25 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h
- 接种: 0.1 ml初始悬液和十倍系列稀释液，用涂布棒表面涂布；每个稀释度1个平板，≥ 2个连续稀释度
- CFC中的抑制剂: 头孢噻吩50 µg/ml、夫西地酸钠10 µg/ml、西曲溴铵10 µg/ml（每100 ml培养基加5 + 1 + 1 ml溶液）
概述
ISO 13720:2010规定了测定肉与肉制品（包括禽肉制品）中所含推定Pseudomonas spp.数的方法。按该标准，推定Pseudomonas spp.是指在25 °C下于含头孢噻吩、夫西地酸钠和西曲溴铵的琼脂（CFC）上形成菌落并且氧化酶试验呈阳性的细菌。在波兰它以PN-EN ISO 13720:2010施行（取代了PN-ISO 13720:1999）。
CFC培养基有商品供应，为基础培养基（Pseudomonas Agar Base，假单胞菌琼脂基础）加CFC添加剂；培养基制造商把它描述为符合ISO 13720（肉与肉制品）的、用于检出和计数Pseudomonas spp.的选择性培养基，而用于乳品（ISO/TS 11059，PP添加剂）和水（ISO 16266，CN添加剂）时使用不同的添加剂。基础培养基的典型组成：明胶胨16.0 g/l、酪蛋白水解物10.0 g/l、无水硫酸钾10.0 g/l、无水氯化镁1.4 g/l、琼脂15.0 g/l，pH 7.1 ± 0.2；硫酸钾和氯化镁有利于绿脓菌素的生成，甘油则是碳源和能源。CFC添加剂含西曲溴铵、夫西地酸和头孢噻啶；在CFC上长出的所有菌落均视为可疑Pseudomonas spp.，而确证的是氧化酶阳性且不发酵葡萄糖的菌落。
方法原理
由样品制备初始悬液和十倍系列稀释液。用一定量的初始悬液接种固体选择性培养基——CFC琼脂，随后的平板用十倍系列稀释液制备；按ISO 7218，每个稀释度用一个平板，并至少取两个连续稀释度。用移液管把0.1 ml初始悬液移至CFC平板，把0.1 ml第一个十倍稀释液（用新的无菌移液管）移至下一个平板，随后用无菌涂布棒把液体涂布于琼脂的整个表面。平板在25 °C ± 1 °C下培养44 h ± 4 h。推定Pseudomonas spp.菌落用氧化酶试验（阳性）确证，每毫升或每克的菌数由每个平板上确证菌落的数目计算。完全培养基由基础培养基制备（灭菌后在25 °C下pH 7.2 ± 0.2；121 °C灭菌15 min），在水浴中冷却至47 °C ± 2 °C后加入抑制剂溶液：每100 ml培养基加5 ml头孢噻吩溶液（终浓度50 µg/ml）、1 ml夫西地酸钠溶液（10 µg/ml）和1 ml西曲溴铵溶液（10 µg/ml）；抑制剂溶液在5 °C ± 3 °C下保存不得超过7天。向无菌平板中倾注约15 ml完全培养基；未干燥的平板可在5 °C ± 3 °C下保存至4周。
应用领域
- 肉与肉制品，包括禽肉制品——推定Pseudomonas spp.的计数（标准的适用范围）
- 按制造商说明的CFC培养基：从肉与肉制品、乳制品、水和环境样品中分离Pseudomonas spp.
- 检验肉类原料的企业实验室和官方实验室——商品培养基（基础培养基 + CFC添加剂）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养 | 25 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h |
| 接种 | 0.1 ml初始悬液和十倍系列稀释液，用涂布棒表面涂布；每个稀释度1个平板，≥ 2个连续稀释度 |
| CFC中的抑制剂 | 头孢噻吩50 µg/ml、夫西地酸钠10 µg/ml、西曲溴铵10 µg/ml（每100 ml培养基加5 + 1 + 1 ml溶液） |
| 基础培养基 | 灭菌后（121 °C，15 min）pH 7.2 ± 0.2；在47 °C ± 2 °C下加入抑制剂；约15 ml/平板 |
| 确证 | 氧化酶试验阳性 |
| 保存 | 抑制剂溶液在5 °C ± 3 °C下 ≤ 7天；未干燥的平板在5 °C ± 3 °C下 ≤ 4周 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010)
- 标准名称（波兰语）
- Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie liczby przypuszczalnych Pseudomonas sp.
- 标准名称（英语）
- Meat and meat products — Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.
分步操作程序
-
CFC琼脂的制备
配制基础培养基（灭菌后pH 7.2 ± 0.2），在121 °C下灭菌15 min，在水浴中冷却至47 °C ± 2 °C，每100 ml加入5 ml头孢噻吩溶液、1 ml夫西地酸钠溶液和1 ml西曲溴铵溶液（溶液在5 °C ± 3 °C下 ≤ 7天）；小心混匀并向无菌平板中倾注约15 ml（未干燥的平板在5 °C ± 3 °C下 ≤ 4周）。
-
初始悬液和稀释液
由肉样制备初始悬液和十倍系列稀释液。
-
表面涂布
用移液管把0.1 ml初始悬液移至CFC平板；用新的无菌移液管把0.1 ml第一个十倍稀释液移至下一个平板（每个稀释度一个平板，至少两个连续稀释度）。用无菌涂布棒把液体涂布于琼脂的整个表面。
-
培养
把平板在25 °C ± 1 °C下培养44 h ± 4 h。
-
确证
用氧化酶试验（阳性）确证推定Pseudomonas spp.菌落。
-
计算与结果
由每个平板上确证菌落的数目计算样品中每克或每毫升的推定Pseudomonas spp.数。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱25 °C ± 1 °C | 培养44 h ± 4 h | — |
| 高压灭菌器121 °C | 基础培养基灭菌15 min | — |
| 水浴47 °C ± 2 °C | 加入抑制剂前冷却培养基 | — |
| 分度为0.1 ml的1 ml无菌移液管（ISO 835） | 量取0.1 ml | — |
| 无菌涂布棒和培养皿 | 表面涂布 | — |
| 均质器（如拍击式Stomacher）、pH计 | 初始悬液、pH的控制 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| CFC基础培养基（Pseudomonas Agar Base） | — | 选择性琼脂的基础；pH 7.2 ± 0.2 |
| 头孢噻吩溶液 | — | 抑制剂——在完全培养基中为50 µg/ml |
| 夫西地酸钠溶液 | — | 抑制剂——10 µg/ml |
| 西曲溴铵溶液 | — | 抑制剂——10 µg/ml |
| 氧化酶试剂 | — | 菌落的确证（Pseudomonas为氧化酶阳性） |
| 制备初始悬液用的稀释液 | — | 十倍系列稀释 |
职业健康与安全
- 生鲜肉可能含病原体（Salmonella、Campylobacter）——无菌操作、消毒、对培养物高压灭菌
- 抗生素（头孢噻吩、夫西地酸）和西曲溴铵——避免吸入粉末和接触皮肤，戴手套
- 47 °C的培养基和高压灭菌后的物品——有烫伤危险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 13720:2010 (ISO 13720:2010) — 《Meat and meat products — Enumeration of presumptive Pseudomonas spp.》。
该方法的原理是什么？
由样品制备初始悬液和十倍系列稀释液。用一定量的初始悬液接种固体选择性培养基——CFC琼脂，随后的平板用十倍系列稀释液制备；按ISO 7218，每个稀释度用一个平板，并至少取两个连续稀释度。
测量范围和准确度是多少？
培养：25 °C ± 1 °C，44 h ± 4 h；接种：0.1 ml初始悬液和十倍系列稀释液，用涂布棒表面涂布；每个稀释度1个平板，≥ 2个连续稀释度；CFC中的抑制剂：头孢噻吩50 µg/ml、夫西地酸钠10 µg/ml、西曲溴铵10 µg/ml（每100 ml培养基加5 + 1 + 1 ml溶液）；基础培养基：灭菌后（121 °C，15 min）pH 7.2 ± 0.2；在47 °C ± 2 °C下加入抑制剂；约15 ml/平板。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱25 °C ± 1 °C、高压灭菌器121 °C、水浴47 °C ± 2 °C、分度为0.1 ml的1 ml无菌移液管（ISO 835）、无菌涂布棒和培养皿、均质器（如拍击式Stomacher）、pH计。
该检测用于哪些场景？
肉与肉制品，包括禽肉制品——推定Pseudomonas spp.的计数（标准的适用范围）；按制造商说明的CFC培养基：从肉与肉制品、乳制品、水和环境样品中分离Pseudomonas spp.；检验肉类原料的企业实验室和官方实验室——商品培养基（基础培养基 + CFC添加剂）。
需要采取哪些安全防护措施？
生鲜肉可能含病原体（Salmonella、Campylobacter）——无菌操作、消毒、对培养物高压灭菌；抗生素（头孢噻吩、夫西地酸）和西曲溴铵——避免吸入粉末和接触皮肤，戴手套；47 °C的培养基和高压灭菌后的物品——有烫伤危险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 13720。