注册
LabCoda / 知识库 / 水中铜绿假单胞菌

🧫 水中铜绿假单胞菌

微生物 PN-EN ISO 16266

以膜过滤法在 CN 培养基（西曲溴铵-萘啶酸）上检出并定量测定水中铜绿假单胞菌。瓶装水与泳池水的关键致病菌。

要点速览

  • 标准: PN-EN ISO 16266:2009
  • 类别: 微生物
  • 操作步骤数: 10
  • 各步骤合计时间: 3 天 16 小时 52 分钟–4 天 52 分钟
  • 结果: cfu/250 mL（瓶装水）或 cfu/100 mL
  • 限值: 0 cfu/250 mL（瓶装水）
  • 培养温度: 36 ± 2 °C

概述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是革兰氏阴性需氧杆菌，也是水环境中最重要的条件致病菌之一。该菌可在营养极低的水中繁殖，在供水系统表面形成生物膜，并对多种消毒剂与抗生素具抵抗力。它可引起伤口感染、外耳道炎（游泳者耳炎）、泌尿道感染，以及免疫抑制患者的严重医院感染。

P. aeruginosa 并非典型的粪便污染指示菌 —— 主要来自环境（土壤、植被、管路生物膜）。瓶装水或泳池水中检出该菌，表明生产、贮存或配送环节存在卫生问题。它是瓶装水、泳池水与医疗机构用水的必测项目。

按 PN-EN ISO 16266 的方法采用膜过滤并在含西曲溴铵（十六烷基三甲基溴化铵 —— 一种阳离子表面活性剂，可抑制除假单胞菌外的多数细菌）与萘啶酸（抑制对喹诺酮敏感的革兰氏阴性菌）的选择性培养基上培养。P. aeruginosa 菌落会产生特征色素：绿脓菌素（蓝绿色）或荧光素（黄绿色荧光）。

确认试验包括由乙酰胺产氨试验（奈氏试剂）—— P. aeruginosa 为阳性 —— 以及可选的 42 °C 生长试验与氧化酶试验。

方法原理

水样经 0,45 µm 滤膜过滤后置于含西曲溴铵（0,2 g/L）与萘啶酸（15 mg/L）的 CN 培养基（Pseudomonas CN 琼脂）上，于 36±2 °C 培养 40–48 小时。西曲溴铵作为阳离子表面活性剂破坏细胞膜，可抑制除假单胞菌属外的多数细菌。P. aeruginosa 会产生可溶性色素：绿脓菌素（蓝绿色，日光下可见）和／或荧光素（黄绿色，365 nm 紫外下荧光）。产生绿脓菌素的菌落无需进一步确认；有荧光或呈棕红色的菌落则需做乙酰胺试验。

应用领域

关键参数

参数数值
结果cfu/250 mL（瓶装水）或 cfu/100 mL
限值0 cfu/250 mL（瓶装水）
培养温度36 ± 2 °C
培养时间40–48 小时
紫外灯365 nm，用于观察荧光
取样量250 mL（瓶装水）、100 mL（其他）

标准

标准编号
PN-EN ISO 16266:2009
标准名称（波兰语）
Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej
标准名称（英语）
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration

分步操作程序

  1. 工作台准备

    对过滤装置灭菌，准备 Pseudomonas CN 琼脂平板（使用前 30 分钟从冰箱取出）。

    ⏱ 时间: 20 分钟

  2. 膜过滤

    将 250 mL 样品（瓶装水）或 100 mL（其他水）经 0,45 µm 滤膜过滤，用无菌蛋白胨水冲洗滤杯。

    ⏱ 时间: 5 分钟

  3. 转移至培养基

    用无菌镊子将滤膜移至 Pseudomonas CN 琼脂表面，避免产生气泡。

    ⏱ 时间: 2 分钟

  4. 培养

    将平板倒置，于 36±2 °C 培养 40–48 小时。24 小时后可作初步观察。

    ⏱ 时间: 40–48 小时 • 🌡 温度: 36 ± 2 °C

  5. 判读 —— 绿脓菌素

    在日光下观察菌落。蓝绿色菌落（绿脓菌素）即可确认为 P. aeruginosa，无需进一步试验。

    ⏱ 时间: 5 分钟

  6. 判读 —— 紫外荧光

    在 365 nm 紫外灯下观察平板。呈黄绿色荧光但无绿脓菌素的菌落须做确认试验。

    ⏱ 时间: 5 分钟

  7. 确认试验 —— 乙酰胺

    将需确认的菌落接种至乙酰胺培养基管，36 °C 培养 24 小时，加入奈氏试剂 —— 呈黄色即表示产氨 = P. aeruginosa 阳性。

    ⏱ 时间: 24 小时 • 🌡 温度: 36 °C

  8. 42 °C 生长试验（可选）

    将菌落接种至营养琼脂，42 °C 培养 24 小时。能生长即确认为 P. aeruginosa（其他假单胞菌在 42 °C 不生长）。

    ⏱ 时间: 24 小时 • 🌡 温度: 42 °C

  9. 结果计算

    结果 = 确认菌落数 / 取样体积，以 cfu/250 mL（瓶装水）或 cfu/100 mL 报告。

  10. 质量控制

    阳性对照：P. aeruginosa ATCC 27853；阴性对照：无菌水；选择性对照：E. coli ATCC 25922（不生长）。

    ⏱ 时间: 15 分钟

所需设备与仪器

设备示例参考价格
膜过滤装置Sartorius Combisart、Merck EZ-Fit3 000–12 000 PLN
真空泵KNF Laboport N 8103 000–8 000 PLN
36 °C 培养箱Binder BD 56、Memmert IN305 000–15 000 PLN
365 nm 紫外灯（伍德灯）Vilber Lourmat VL-6.L、Analytik Jena UVhand500–3 000 PLN
高压灭菌器Tuttnauer ELV 254020 000–45 000 PLN
42 °C 培养箱（确认用）Binder BD 235 000–15 000 PLN
生物安全柜Esco Airstream15 000–40 000 PLN

试剂、培养基与耗材

试剂CAS详情
Pseudomonas CN 琼脂—含西曲溴铵、萘啶酸与甘油的选择性培养基。厂商：Oxoid、Merck、Biokar
西曲溴铵（十六烷基三甲基溴化铵）57-09-0阳离子表面活性剂，选择性抑制剂，培养基中浓度 0,2 g/L
萘啶酸389-08-2抑制敏感革兰氏阴性菌，培养基中浓度 15 mg/L
奈氏试剂（K₂HgI₄）7783-33-7用于检测由乙酰胺产生的氨 —— 呈黄／棕色为阳性。注意：含汞！
乙酰胺（CH₃CONH₂）60-35-5确认试验用培养基 —— P. aeruginosa 可将乙酰胺脱氨生成氨
0,45 µm 滤膜—MCE，47 mm，无菌。Merck Millipore、Sartorius
硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）7772-98-7中和样品中的氯

职业健康与安全

常见问题

该检测依据哪项标准？

该检测依据的标准为 PN-EN ISO 16266:2009 — 《Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration》。

该方法的原理是什么？

水样经 0,45 µm 滤膜过滤后置于含西曲溴铵（0,2 g/L）与萘啶酸（15 mg/L）的 CN 培养基（Pseudomonas CN 琼脂）上，于 36±2 °C 培养 40–48 小时。西曲溴铵作为阳离子表面活性剂破坏细胞膜，可抑制除假单胞菌属外的多数细菌。

测量范围和准确度是多少？

结果：cfu/250 mL（瓶装水）或 cfu/100 mL；限值：0 cfu/250 mL（瓶装水）；培养温度：36 ± 2 °C；培养时间：40–48 小时。

完成检测需要多长时间？

各步骤所列时间合计约为 3 天 16 小时 52 分钟–4 天 52 分钟。整个程序共 10 个步骤。

需要哪些设备？

膜过滤装置、真空泵、36 °C 培养箱、365 nm 紫外灯（伍德灯）、高压灭菌器、42 °C 培养箱（确认用）、生物安全柜。核心仪器的参考价格（膜过滤装置）：3 000–12 000 PLN。

该检测用于哪些场景？

瓶装水与泉水检测（必测项目）；泳池与水上乐园用水监测；医院与医疗机构用水控制；公共建筑饮用水检测；冷却系统（冷却塔）水质评价；配水系统生物膜控制；透析与制药用水检测。

需要采取哪些安全防护措施？

P. aeruginosa —— 条件致病菌，BSL-2。佩戴手套、护目镜并穿实验服，在生物安全柜中操作；奈氏试剂 —— 含汞（Hg），剧毒！只能在通风柜中使用，佩戴丁腈手套，按危险废物处置；西曲溴铵 —— 刺激皮肤与眼睛，佩戴防护手套；萘啶酸 —— 避免接触皮肤，可能引起过敏反应；感染性材料 —— 处置前 121 °C/30 分钟高压灭菌。

哪家实验室可以开展此项检测？

该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 16266。

🔍 查找可开展此项检测的实验室