🦠 水中的Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）——酶底物培养基最可能数法MPN（Pseudalert / Quanti-Tray）

微生物 PN-EN ISO 16266-2

概述

ISO 16266-2:2018规定了基于在液体培养基中生长并由表格计算最可能数（MPN）来定量测定水中Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）的方法。它适用于多种水：医院用水、饮用水、非充气瓶装水、地下水、泳池水和水疗浴缸水，包括异养菌本底高的水。它不适用于充气和加味的瓶装水、冷却塔水和海水，该方法未针对这些水进行验证——实验室经自行验证后可在这些场合使用。瓶装水通常检验250 ml，其余的检验100 ml。250 ml中不得检出P. aeruginosa的要求原出自第98/83/WE号指令，该指令已被第2020/2184号指令（欧盟）废止；在波兰2026年5月22日的条例（Dz.U. 2026 poz. 748［2026年《波兰法律公报》第748项］）中，P. aeruginosa列于附件1第A部分表2和表3——针对运输工具的罐车和水箱中的水，体积为100 ml，而非针对灌装入瓶的水。该方法也适用作定性程序（检出／未检出）。

该试验基于细菌酶检测技术：活跃生长的P. aeruginosa菌株具有可裂解培养基中所含7-氨基-4-甲基香豆素氨肽酶底物的酶，释放出在紫外光下发荧光的产物；丰富的氨基酸、维生素和营养成分使细菌快速生长。结果在24 h内即得确证，无需对阳性孔作进一步确证。多数P. aeruginosa菌株能在42 °C下生长而不能在4 °C下生长，这一点使它区别于P. fluorescens（荧光假单胞菌）。标准引用了Pseudalert和Quanti-Tray商品。在波兰它以PN-EN ISO 16266-2:2022-04（波兰文版和英文版）施行。制造商对Pseudalert给出的条件相同：在(38 ± 0.5) °C下培养24–28 h，在紫外光下读取荧光，检出水平1 CFU/100 ml。

方法原理

把一包（snap pack）脱水培养基——每100 ml用2.45 g——加入100 ml或250 ml水样或补足至100 ml的稀释液中，轻轻振摇至溶解。作定量测定时，把加有培养基的100 ml样品无菌地倒入Quanti-Tray定量盘（至多201个微生物/100 ml；预期数 < 200 MPN/100 ml）或Quanti-Tray/2000（至多2419个微生物/100 ml），在Quanti-Tray封口机中封盘，并在(38 ± 0.5) °C下培养24–28 h；结果在24 h后即得确证，但可读至28 h。对于250 ml，把样品分入三个无菌透明容器：两份各100 ml，一份50 ml并用50 ml无抑制性、不含氧化剂的无菌水补足；向每份中加入一包培养基并倒入三个定量盘，这些盘必须明确标记（盛50 ml那一份的盘计数方式不同）。培养后，凡在长波紫外（365 nm）下相对于阴性对照呈现任何程度蓝色荧光的容器或孔均判为阳性；24 h后若有疑问，可把培养延长至28 h。每100 ml或250 ml的MPN由统计表（B.1、B.2）或软件查得；250 ml采用适用于三个定量盘的公式B.2。Quanti-Tray的孔约1.96 ml，溢流孔约8.5 ml；Quanti-Tray/2000中小孔约0.16 ml，大孔约1.9 ml，溢流孔约11 ml（与大孔一并计数）。培养基也可倒入无菌试管作经典MPN布局（如1 × 50 ml和5 × 10 ml），或把整份样品作检出／未检出试验培养。质量控制：生长性能——P. aeruginosa WDCM 00024（蓝色荧光，相对TSA的PR ≥ 0.5），选择性——P. fluorescens WDCM 00115（完全抑制，无荧光）。

应用领域

• 医院和医疗机构中的水（P. aeruginosa为管网中的机会性致病菌）
• 饮用水和非充气瓶装水——250 ml中不得检出P. aeruginosa的要求
• 泳池水和水疗浴缸水、地下水——也包括异养菌本底高的水
• 检出／未检出试验以及用同一培养基的经典MPN试管布局
• 自来水公司和卫生防疫站的实验室——结果24 h后即得确证，无需确证性接种

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 16266-2:2022-04 (ISO 16266-2:2018)

标准名称（波兰语）

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

标准名称（英语）

Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable number method

分步操作程序

1. 采样与运输

   按ISO 19458的规定采样；在采样当天或12 h内开始检验；特殊情况下于(5 ± 3) °C保存至多24 h，并在报告中注明保存时间。

2. 加入培养基——100 ml

   向无菌透明容器中的100 ml样品（或补足至100 ml的稀释液）中无菌地加入一包Pseudalert培养基，并混合至完全溶解。

3. 加入培养基——250 ml

   把样品分入三个容器：100 ml、100 ml和50 ml；50 ml那一份用50 ml无抑制性、不含氧化剂的无菌水补足。向每一份中加入一包培养基并混匀；标记各定量盘（注明哪一个盛的是50 ml那一份）。

4. 倒盘与封口

   把加有培养基的每一份倒入Quanti-Tray（预期 < 200 MPN/100 ml）或Quanti-Tray/2000定量盘并封口。也可倒入无菌试管作MPN布局（如1 × 50 ml和5 × 10 ml），或把整份作检出／未检出试验培养。

5. 培养

   把定量盘或容器在(38 ± 0.5) °C下培养24–28 h。

6. 读数

   在365 nm紫外光下与阴性对照比较观察：凡呈现任何程度蓝色荧光的孔即为P. aeruginosa阳性。24 h后荧光可疑时，把培养延长至28 h；橡胶衬垫便于读数。

7. 计算与报告

   由阳性孔数从表B.1/B.2或软件查得MPN/100 ml；250 ml则按公式B.2由三个定量盘计算MPN。报告中给出方法、样品标识、结果以及是否曾于(5 ± 3) °C保存至多24 h。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• P. aeruginosa是机会性致病菌——应在微生物实验室条件下工作，用过的定量盘须高压灭菌
• 365 nm紫外灯——读数时保护眼睛和皮肤
• 封口机会发热——不要触碰加热元件

常见问题