🦠 食品中的推定Escherichia coli（大肠埃希氏菌）——最可能数法MPN（月桂基肉汤37 °C → EC肉汤44 °C → 吲哚）

微生物 PN-ISO 7251

概述

ISO 7251:2005给出了用液体培养基培养、在37 °C随后44 °C培养后计算最可能数（MPN）的技术检出和计数推定Escherichia coli的一般指南；它适用于供人食用和动物饲用的产品以及来自食品生产和流通的环境样品。注意：某些致病性E. coli菌株不能在44 °C下生长。其局限在于该方法的变异性大（第10章）。第三版取代了ISO 7251:1993以及ISO 11866-1:1997和IDF 170-1:1999；主要变化有：第二次培养的温度为44 °C ± 1 °C、把检出与计数一并纳入、对某些产品允许每个稀释度用五支试管、关于乳制品妨碍集气的提示、按ISO 7218计算MPN。推定E. coli定义为在44 °C下发酵乳糖并产气、且在44 °C下由色氨酸产生吲哚的细菌。在波兰的食品实验室中，该方法（PN-ISO 7251:2006）与ISO 16649平板法并用，用于在预期数量很少的产品中测定E. coli；UWM（瓦尔米亚－马祖里大学）的讲义描述了在3管布局中对Enterobacteriaceae和大肠菌群作类似的MPN测定。

方法原理

检出：用规定量的初始悬液接种液体选择性增菌肉汤并在37 °C下培养至48 h，在24 h和48 h检查产气情况；出现浑浊或产气时转接到EC肉汤并在44 °C下培养至48 h；产气的试管转接到不含吲哚的蛋白胨水中，在44 °C下培养48 h，随后检查由色氨酸产生吲哚的情况；在EC中产气且有吲哚的试管判定为含有推定E. coli（结果为“在x g或x ml中检出／未检出”）。计数：用规定量的初始悬液接种三支双倍浓度和三支单倍浓度的肉汤，后续的每三支用十倍稀释液接种；操作同上，MPN则按转接后在44 °C下于EC中产气并产生吲哚的试管数由表格（附录A）查得。月桂基硫酸盐肉汤：植物和动物组织水解物20 g（双倍浓度40 g）、乳糖5 g（10 g）、K₂HPO₄ 2.75 g（5.5 g）、KH₂PO₄ 2.75 g（5.5 g）、NaCl 5 g（10 g）、月桂基硫酸钠0.1 g（0.2 g）/l；pH 6.8 ± 0.2；单倍浓度为带杜氏小管的16 × 160 mm试管中9 ml，双倍浓度为带小管的18 × 180或20 × 200 mm试管中10 ml；121 °C 15 min。EC肉汤：酪蛋白水解物20 g、乳糖5 g、3号胆盐1.5 g、K₂HPO₄ 4 g、KH₂PO₄ 1.5 g、NaCl 5 g/l；pH 6.8 ± 0.2；带杜氏小管10 ml。不含吲哚的蛋白胨水：酪蛋白水解物10 g、NaCl 5 g/l；pH 7.3 ± 0.2；5–10 ml。Kovacs试剂：4-二甲氨基苯甲醛5 g、2-甲基丁-1-醇或戊-1-醇75 ml、盐酸（ρ 1.18–1.19）25 ml；在50–55 °C水浴中溶解，避光保存于约4 °C；颜色为淡黄色至浅棕色。

应用领域

• 食品（肉、乳制品、熟食制品、即食食品）中少量E. coli的检出和计数
• 来自食品生产和流通区域的环境样品
• 饲料和原料
• 乳制品——须注意其可能妨碍杜氏小管中集气（允许每个稀释度用5支试管）
• 当预期水平低于平板法（ISO 16649）的定量限时对其加以补充

关键参数

标准

标准编号

PN-ISO 7251:2006 (ISO 7251:2005)

标准名称（波兰语）

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby przypuszczalnych Escherichia coli — Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

标准名称（英语）

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique

分步操作程序

1. 样品

   按ISO 6887-1至-4（乳：ISO 8261）或产品标准制备样品、初始悬液和十倍稀释液。

2. 接种月桂基硫酸盐肉汤

   检出：把规定量的初始悬液加入一支肉汤试管。计数：用规定量的悬液各接种三支双倍浓度和三支单倍浓度的肉汤试管，并用后续的十倍稀释液各接种三支单倍浓度的试管。

3. 37 °C下培养

   在37 °C下培养至48 h；在24 h和48 h检查产气情况（乳制品可能妨碍集气）。

4. 转接到EC肉汤

   从每一支出现浑浊或产气的双倍浓度试管以及每一支产气的单倍浓度试管，用接种环转接到EC肉汤；在44 °C下培养至48 h，并在24 h和48 h检查产气情况。

5. 吲哚试验

   从产气的EC试管转接到不含吲哚的蛋白胨水中，在44 °C下培养48 h并加入Kovacs试剂——产生吲哚（显色）表明为推定E. coli。

6. 结果

   检出：在x g或x ml中推定E. coli的检出／未检出。计数：按转接后在EC中产气并产生吲哚的单倍浓度和双倍浓度试管数，从附录A的表格查得MPN（按ISO 7218计算）；报告中应计入方法的变异性和偏离情况。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• E. coli培养物可能包括致病菌株——在微生物实验室中操作，对废弃物高压灭菌
• Kovacs试剂含浓盐酸和戊醇类——在通风柜中操作，保护眼睛和双手
• 44 °C下培养——控制水浴温度；产气的试管须小心开启

常见问题