🍎 由油脂制备脂肪酸甲酯（FAME）——四种方法：KOH甲醇溶液快速酯交换（5.2）、碱–酸通用程序（5.3）、BF3法（5.4）和酸催化酯交换（5.5），PN-EN ISO 12966-2

食品化学 PN-EN ISO 12966-2

概述

本标准的内容。我们有ISO 12966-2:2017（第二版）的预览——从目录到5.2.5开头（15页中的第3页）；PN-EN ISO 12966-2:2017-05原样采用该文本（IDT）。范围（第1章）：由动物和植物油脂、脂肪酸和皂制备脂肪酸甲酯的方法——四种甲酯化方法：（a）碱性条件下的“快速”酯交换，（b）先碱性后酸性条件下的“通用”酯交换/甲酯化，（c）BF3酯交换，（d）另一种酸催化的甘油酯酯交换。所得甲酯用于气相色谱（GLC）、薄层色谱（TLC）和红外光谱（IR）。乳和乳制品（及其来源的脂肪）被排除在范围之外——根据前言，这是与2011版相比唯一的变化。

为何制备甲酯以及如何选择方法（引言和第4章）。三酰甘油挥发性不足，游离脂肪酸的色谱行为差，因此在气相色谱前先制成甲酯；转化不完全、脂肪酸结构改变（位置异构体和几何异构体）以及非FAME的假峰都会改变组成结果。酯交换是可逆的——需要大大过量的甲醇，水会妨碍反应完成；碱性程序不能由游离脂肪酸生成FAME（会生成皂）。快速法（5.2）适用于含丁酸（C4:0）及以上脂肪酸的食用油脂的常规分析，以及用内标测定丁酸和己酸，但不能使游离脂肪酸酯化；本标准建议仅在游离脂肪酸含量 ≤ 0.5%（m/m）时使用，高于0.5%时使用通用法（5.3）；部分水解的脂肪可按5.5程序转化为FAME。通用法适用于所有油脂，包括馏出物和酸化油，但不推荐用于月桂酸类油脂——短链酯在回流加热时会损失。BF3——由于其毒性，只能“作为最后手段”，不用于乳脂；高浓度BF3（50%）会使不饱和脂肪酸产生甲氧基假峰，该试剂保质期有限（冷藏保存），每一新批次在使用前都要检验。酮基、环氧基、羟基和氢过氧基，环丙基和环丙烯基环以及炔酸在甲酯化过程中可能分解。使用BF3时，异辛烷对甲酯的回收率最好，但己酸甲酯的回收率仅约75%。短链酯会因挥发（回流加热）、水溶性（水相萃取）以及溶剂蒸发而损失；附录A给出了一种简单的TLC试验，用于检查衍生化是否完全。

快速法——预览中包含的内容（5.2）。原理：用氢氧化钾甲醇溶液进行酯交换生成甲酯；游离脂肪酸不被酯化。试剂：含水量不超过0.5%的甲醇，符合ISO 3696的3级水，无水硫酸氢钠，色谱纯异辛烷（2,2,4-三甲基戊烷），约2 mol/l的氢氧化钾甲醇溶液（13.1 g含量为85 g/100 g的KOH溶于100 ml无水甲醇，稍加热溶解），内标——戊酸甲酯（缬草酸甲酯，250 mg置于50 ml容量瓶中用异辛烷定容；参比溶液为10 ml稀释至100 ml）——仅用于测定丁酸和己酸，以及氯化钠溶液（40 g溶于100 ml水）。每一新批次试剂都要通过制备纯油酸的甲酯进行检验——出现额外的峰则该试剂不合格。仪器：带PTFE密封垫螺旋盖的10 ml试管，符合ISO 8655-2的移液器，3 ml样品瓶，符合ISO 1042的A级容量瓶。5.2.1的注：按COI/T.20/Doc. No. 24:2001，类似程序用于橄榄油（酸度低于3.3%的初榨橄榄油、精炼橄榄油、调和橄榄油）和橄榄果渣油。操作从在10 ml试管中称取约0.1 g试样开始——此后预览中断。

状态（目录卡状态截至2026年9月29日）。PN-EN ISO 12966-2:2017-05（波兰文版）目录卡上没有“已废止”标记——本标准为现行标准：波兰文版发布日期2022-11-14，24页，价格组M，食品、农业与林业部门，KT 92油籽、植物油脂和动物油脂及其副产品技术委员会，ICS 67.200.10，“采用：EN ISO 12966-2:2017 [IDT]，ISO 12966-2:2017 [IDT]”，“替代：PN-EN ISO 12966-2:2011 - 英文版”。同一版本英文版的目录卡：发布日期2017-05-17，30页，价格组P，“范围”栏相同。PN-EN ISO 12966-2:2011（英文版）目录卡：“已废止，由PN-EN ISO 12966-2:2017-05替代”，发布日期2011-03-31，“废止日期：2017-05-17”，17页，“替代：PN-EN ISO 5509:2001 - 波兰文版”。ISO 12966-2:2017已于2022年复审并确认（ISO网站上的标准页面）。

实验室数量及书写形式（认可范围数据库副本，数据截至2026年9月17日，读取于2026年9月29日）。编号12966-2的所有写法：11家实验室的19个条目。“PN-EN ISO 12966-2:2017-05”——10家实验室，不带年份的“PN-EN ISO 12966-2”——AB 444。许多实验室将本标准限定为一种或两种方法（这些附注在PCA文件和本服务数据库中都紧跟在标准编号之后）：仅快速法5.2——AB 539（“不包括5.3、5.4、5.5条”）和AB 1179（“第5.2条”）；仅通用法5.3——AB 819（“第5.3条”）；5.2和5.3——AB 565（“5.2条、5.3条”）和AB 1679（“不包括5.4和5.5条”）；仅BF3法（5.4）——AB 562（“不包括5.2、5.3和5.5条”，三个条目）；整个标准——AB 343、AB 444、AB 515、AB 552和AB 775。“实验室”选项卡检索以“PN-EN ISO 12966-2”开头的写法，显示全部11家实验室——已于2026年9月29日在labcoda.pl生产服务器上用该选项卡的查询核实：11家。PCA网站上的现行认可范围（读取于2026年9月29日，版次从2025.11.03到2026.09.18）：所有条目均在有效版次中，副本中的每一对范围数值都出现在现行文件中，没有条目被暂停（AB 1179认可范围中关于暂停的脚注涉及其他条目）。

对象和测定量。芥酸——AB 343（植物油脂、婴儿配方食品、芥末）、AB 539（油类）、AB 552（油类、特殊营养用途食品、芥末）、AB 562（油脂、婴儿配方食品）、AB 565（食用油脂）和AB 775（油菜籽）——范围从(0.1 – 1.5)%（AB 343，婴儿配方食品）到脂肪的(10.0 – 55.0)%（AB 552，芥末）；AB 565仅以g/kg给出范围——(1.0 – 50.0) g/kg。脂肪酸组成（从C4:0或C6:0起）——AB 444、AB 515、AB 819、AB 1179和AB 1679（还有液体生物燃料：植物油），AB 562——ω-3脂肪酸和亚油酸。所有情况下的技术：气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）。AB 562关于ω-3脂肪酸的条目（BF3法）的对象还包括乳和乳制品——2017版将其排除在本标准范围之外，且引言将乳脂排除在BF3法之外。

本标准之外。相同条目中：PN-EN ISO 12966-4:2015-07（用毛细管气相色谱法测定）——9家实验室（AB 343、AB 444、AB 515、AB 552、AB 562、AB 775、AB 819、AB 1179、AB 1679）以及PN-EN ISO 12966-1:2015-01（带或不带勘误AC:2015-06）——8家（AB 515、AB 539、AB 552、AB 562、AB 775、AB 819、AB 1179、AB 1679）；此外还有PN-ISO 1444:2000——AB 343（用于油类、婴儿配方食品和芥末），程序IB-05（2021.05.12第6版）和IB-17（2021.03.10第4版）——AB 1179。PN-EN ISO 12966-1在知识库中有单独条目。PN-EN ISO 12966-4:2015-07目录卡（波兰文版，状态截至2026年9月29日）：“已废止，由PN-EN ISO 12966-4:2026-08 - 英文版替代”，波兰文版发布日期2022-10-03，“废止日期：2026-08-31”，28页，KT 92，“附加信息”栏中：“合格评定中现行：2026-09-30——见PKN主席公告”；PN-EN ISO 12966-4:2026-08（英文版）目录卡：发布日期2026-08-31，52页，“采用：EN ISO 12966-4:2026 [IDT]，ISO 12966-4:2026 [IDT]”，“替代”2015-07版的两个语言版本。其中8家实验室的认可范围中为2015-07版，AB 444——不带年份的写法。2015-07版目录卡的“范围”栏：用毛细管GLC测定由油脂和脂肪酸酯交换或酯化得到的FAME的方法，可分离C8至C24的脂肪酸甲酯——饱和脂肪酸以及顺式和反式单不饱和、多不饱和脂肪酸的甲酯；不适用于反刍动物乳脂和添加共轭亚油酸（CLA）的产品，乳和乳制品不在范围内，不适用于二聚、三聚、聚合和氧化脂肪酸。2026-08版目录卡的“范围”栏：可分离C4至C24的甲酯（同样包括饱和脂肪酸以及顺式和反式单不饱和、多不饱和脂肪酸），也适用于从食品中提取的脂肪；不适用于乳和乳制品或添加CLA的产品，不适用于二聚、三聚、聚合、羟基化和氧化脂肪酸；附录E——以峰面积%表示的液态植物油FAME组成。在这些条目中，AB 444、AB 819和AB 1179测定丁酸（C4:0），AB 515以己酸（C6:0）为清单中的第一种脂肪酸——均与2015-07版第4部分一起引用（AB 444不带年份）；在第2部分中，短链由带内标的快速法（5.2）涵盖；对于第2部分，AB 1179仅引用5.2，AB 819仅引用通用法5.3，AB 444和AB 515引用整个标准。PN-ISO 1444:2000（波兰文版）目录卡：没有“已废止”标记，“肉和肉制品——游离脂肪含量的测定”，用正己烷或石油醚萃取干燥残渣，发布日期2000-06-14，7页，KT 93肉、蛋及其制品技术委员会，采用ISO 1444:1996 [IDT]。不依据本标准测定芥酸的有8家实验室，均按自有程序（AB 311、AB 313、AB 377、AB 381、AB 438、AB 509、AB 591、AB 1275）；这些行均在PCA现行认可范围中，未被暂停（读取于2026年9月29日）。

容易得到表面正确结果的地方。快速法不能使游离脂肪酸酯化：此时组成结果描述的是甘油酯中结合的脂肪酸，而溶液中的游离脂肪酸可能产生额外的峰并妨碍甲酯的鉴定（第4章）。本标准允许假定游离脂肪酸的分布与甘油三酯相同，但通常只适用于毛油——在精炼油和分提油中可能不同。第二，短链（C4–C6）会在加热时、在水中以及溶剂蒸发时损失——使用BF3时己酸甲酯的回收率仅约75%。第三，陈旧批次或高浓度的BF3会产生假峰——额外的峰可能被当作脂肪酸。

我们不提供的内容。预览在快速法操作步骤开头（5.2.5）结束，因此我们不提供快速法的后续步骤，也不提供通用法（5.3）、BF3法（5.4）或酸催化法（5.5）的试剂和步骤，以及附录A的TLC试验。本部分不规定色谱分离条件——这些见PN-EN ISO 12966-4。

方法原理

将酰基甘油中结合的脂肪酸转化为甲酯：在甲醇中用碱性催化剂进行酯交换（KOH——快速法，不酯化游离脂肪酸），分碱性和酸性两步进行（通用法，也适用于游离脂肪酸），用BF3（游离脂肪酸甲酯化和酯的酯交换），或用酸性催化剂（部分水解的脂肪）。用异辛烷萃取甲酯，并按本标准的另一部分进行气相色谱分析。方法的选择取决于游离脂肪酸含量（≤ 0.5%——快速法，> 0.5%——通用法）、是否存在短链和不稳定基团；BF3——只能作为最后手段。

应用领域

• 油类、油脂、油菜籽、芥末和婴儿配方食品中的芥酸——6家实验室
• 食品、油类和植物油生物燃料的脂肪酸组成（从C4:0起）——6家实验室
• 为GC、TLC和IR制备FAME；不包括乳和乳制品（被排除在2017版范围之外）

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 12966-2:2017-05 (wersja polska z 14-11-2022 i wersja angielska; EN ISO 12966-2:2017, ISO 12966-2:2017 IDT)

标准名称（波兰语）

Oleje i tłuszcze roślinne oraz zwierzęce — Chromatografia gazowa estrów metylowych kwasów tłuszczowych — Część 2: Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych

标准名称（英语）

Animal and vegetable fats and oils — Gas chromatography of fatty acid methyl esters — Part 2: Preparation of methyl esters of fatty acids

分步操作程序

1. 选择方法

   游离脂肪酸含量 ≤ 0.5%——快速法（5.2）；> 0.5%——通用法（5.3）；部分水解的脂肪——5.5；BF3（5.4）只能作为最后手段；乳和乳制品不在范围内。

2. 检验试剂

   每一新批次试剂或溶剂都用纯油酸的甲酯进行检验——出现意外的峰则该试剂不合格。

3. 实验室样品

   按ISO 661；固体脂肪加热至刚高于其熔点（5.1）。

4. 快速法——开始

   在10 ml螺旋盖试管中称取约0.1 g试样；用内标测定时——准确称量；后续步骤在预览范围之外——我们不提供。

5. 色谱分析

   异辛烷中的甲酯按本标准的另一部分（PN-EN ISO 12966-4）进行气相色谱分析；我们不提供该部分内容。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 氢氧化钾甲醇溶液有毒且有腐蚀性——应保护眼睛并防止化学灼伤（第5章中的警告）
• 异辛烷易燃，吞咽和吸入有毒，爆炸极限1.1–6.0%（体积分数）；BF3——有毒，只能作为最后手段；在运行良好的通风橱中操作

常见问题