🦠 食品和饲料中的菌落总数——在30 °C下于PCA上表面涂布法（72 h）
三句话速览
取0.1 ml液体样品或初始悬液及十倍系列稀释液涂布于PCA琼脂表面，静置约15 min使其吸收，并在(30 ± 1) °C下需氧培养72 h；菌数由含菌落少于300个的平板计算。该检测依据 PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022)；培养：(30 ± 1) °C，72 h，需氧，平板翻转。整个程序共 7 个步骤；主要用于：含对热敏感的嗜冷菌群的冷藏和冷冻食品；干燥食品、含专性需氧细菌的产品（如Pseudomonas spp.）、含难以与菌落区分的细小颗粒或颜色浓重的产品，对这些产品倾注平板法妨碍读数。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 7
- 培养: (30 ± 1) °C，72 h，需氧，平板翻转
- 接种物: 0.1 ml样品／初始悬液；稀释度10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；1.0 ml可把限值降低10倍
- 吸收: 翻转前连同皿盖在室温下约15 min
概述
ISO 4833-2:2013规定了测定在30 °C下需氧培养后能够在固体培养基表面生长并形成菌落的微生物数的水平法。它适用于供人食用或作饲料的产品，以及来自食品和饲料生产与流通环节的环境样品。对于下列产品宜采用表面涂布法：所含对热敏感的微生物构成菌群相当大部分的产品（如冷藏和冷冻食品中的嗜冷菌、干燥食品）、含专性需氧细菌的产品（如Pseudomonas spp.）、含在倾注平板法中难以与菌落区分的细小颗粒的产品、颜色浓重而妨碍辨认菌落的产品，以及质量评定需要区分菌落类型的情况。除手工表面涂布外，标准还描述了螺旋接种仪的使用——一种快速计数表面菌落的方法（附录A）。
标准的第1部分（ISO 4833-1）是在30 °C下的倾注平板法——委员会第2073/2005号条例（欧共体）在过程卫生标准（胴体、绞肉中的需氧菌数）中指明的正是这一部分。在波兰它以PN-EN ISO 4833-2:2013-12（2017年的波兰文版；取代了PN-EN ISO 4833:2004）连同A1:2022-06的修改单施行。PIWet-PIB（国家兽医研究所－国家研究院）资料中的方法流程图为：称样x g或x ml → 在9x稀释液中制成初始悬液 → 接种PCA → 在30 °C下培养72 ± 3 h → 读数 → 判读 → 结果的表述。
方法原理
把一定量的样品（液体产品）或初始悬液（其他产品）表面涂布接种于培养皿中的固体琼脂培养基上；随后的平板在相同条件下用十倍系列稀释液制备。用无菌移液管把0.1 ml样品或初始悬液移至一个平板，用新的移液管把0.1 ml的10⁻¹（液体产品）或10⁻²（其他产品）稀释液移至下一个平板，必要时再取更高的稀释度；接种1.0 ml样品或初始悬液可把定量限降低10倍。接种物应均匀并尽可能快地涂布于琼脂表面，平板连同皿盖在室温下静置约15 min使其吸收，随后翻转并在30 °C下需氧培养72 h。培养后选取尽可能含菌落少于300个的平板；蔓延菌落按单个计数，若预期会出现蔓延菌落，则在24 h或48 h后观察平板并标记可见的菌落。每克或每毫升的菌数由含菌落少于300个的平板上的菌落数计算。培养基（含酵母浸膏的琼脂，PCA）灭菌后在25 °C下pH为7.0 ± 0.2（高压灭菌121 °C，15 min）；检验乳制品时加入脱脂奶粉1.0 g/l；向平板中倾注15–20 ml培养基，平板可在(5 ± 3) °C下保存至4周，使用前应干燥其表面（如在37–55 °C的干燥箱或层流净化工作台中）。
应用领域
- 含对热敏感的嗜冷菌群的冷藏和冷冻食品；干燥食品
- 含专性需氧细菌的产品（如Pseudomonas spp.）
- 含难以与菌落区分的细小颗粒或颜色浓重的产品，对这些产品倾注平板法妨碍读数
- 需要区分菌落类型的质量评定；饲料和环境样品
- 通量大的实验室——螺旋接种法（附录A）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养 | (30 ± 1) °C，72 h，需氧，平板翻转 |
| 接种物 | 0.1 ml样品／初始悬液；稀释度10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；1.0 ml可把限值降低10倍 |
| 吸收 | 翻转前连同皿盖在室温下约15 min |
| 计数 | 菌落 < 300个的平板；蔓延菌落按单个计数（24/48 h后检查） |
| PCA培养基 | 在25 °C下pH 7.0 ± 0.2；15–20 ml/平板；检验乳制品时加脱脂奶粉1.0 g/l；平板在(5 ± 3) °C下 ≤ 4周 |
| 结果 | 样品中每g或每ml的菌数 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 2: Oznaczanie liczby metodą posiewu powierzchniowego w temperaturze 30 °C
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique
分步操作程序
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平板的制备
配制PCA（检验乳制品时加1.0 g/l脱脂奶粉），调节pH使灭菌后（121 °C，15 min）为7.0 ± 0.2，在47–50 °C的水浴中冷却，向无菌平板中倾注15–20 ml并静置凝固（在(5 ± 3) °C下保存 ≤ 4周）。接种前干燥表面。
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初始悬液和稀释液
由x g或x ml的称样在9x稀释液中制成初始悬液和十倍系列稀释液。
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接种
用无菌移液管把0.1 ml液体样品或初始悬液移至一个平板；用新的移液管把0.1 ml的10⁻¹（液体）或10⁻²（其他产品）稀释液移至下一个平板；必要时再取更高的稀释度。为把限值降低10倍，可接种1.0 ml。
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涂布
用涂布棒把接种物均匀并尽可能快地涂布于琼脂的整个表面；把平板连同皿盖在室温下静置约15 min使其吸收。
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培养
翻转平板并在培养箱中于30 °C下培养72 h。
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计数
选取（尽可能）含菌落少于300个的平板。蔓延菌落按单个计数；若预期会出现，则在24 h或48 h后观察平板并标记可见的菌落。
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结果
计算样品中每克或每毫升的菌数，并按标准表述结果。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱(30 ± 1) °C | 培养72 h | — |
| 水浴47–50 °C | 倾注前使琼脂保温 | — |
| 干燥箱37–55 °C或层流净化工作台 | 接种前干燥平板表面 | — |
| 校准至0.1 ml和1 ml的无菌移液管（ISO 835） | 量取接种物 | — |
| 无菌涂布棒、培养皿、pH计（在25 °C下 ± 0.1 pH） | 表面涂布、pH的控制 | — |
| 螺旋接种仪（可选） | 附录A——快速计数表面菌落 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 含酵母浸膏的琼脂（PCA，平板计数琼脂） | — | 菌落计数用非选择性培养基；pH 7.0 ± 0.2 |
| 脱脂奶粉（1.0 g/l） | — | 检验乳制品时向PCA中的添加物 |
| 制备初始悬液和十倍系列稀释液用的稀释液 | — | 样品的制备（每份称样用9x体积） |
职业健康与安全
- 来自食品的混合菌群培养物——无菌操作、对用过的平板高压灭菌
- 47–50 °C的熔化琼脂和高压灭菌器——有烫伤危险
- 螺旋接种仪——按制造商说明书对加样系统消毒
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 4833-2:2013-12 + A1:2022-06 (ISO 4833-2:2013 + Amd 1:2022) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 2: Colony count at 30 °C by the surface plating technique》。
该方法的原理是什么？
把一定量的样品（液体产品）或初始悬液（其他产品）表面涂布接种于培养皿中的固体琼脂培养基上；随后的平板在相同条件下用十倍系列稀释液制备。用无菌移液管把0.
测量范围和准确度是多少？
培养：(30 ± 1) °C，72 h，需氧，平板翻转；接种物：0.1 ml样品／初始悬液；稀释度10⁻¹（液体）或10⁻²（其他）；1.0 ml可把限值降低10倍；吸收：翻转前连同皿盖在室温下约15 min；计数：菌落 < 300个的平板；蔓延菌落按单个计数（24/48 h后检查）。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 7 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱(30 ± 1) °C、水浴47–50 °C、干燥箱37–55 °C或层流净化工作台、校准至0.1 ml和1 ml的无菌移液管（ISO 835）、无菌涂布棒、培养皿、pH计（在25 °C下 ± 0.1 pH）、螺旋接种仪（可选）。
该检测用于哪些场景？
含对热敏感的嗜冷菌群的冷藏和冷冻食品；干燥食品；含专性需氧细菌的产品（如Pseudomonas spp.）；含难以与菌落区分的细小颗粒或颜色浓重的产品，对这些产品倾注平板法妨碍读数；需要区分菌落类型的质量评定；饲料和环境样品；通量大的实验室——螺旋接种法（附录A）。
需要采取哪些安全防护措施？
来自食品的混合菌群培养物——无菌操作、对用过的平板高压灭菌；47–50 °C的熔化琼脂和高压灭菌器——有烫伤危险；螺旋接种仪——按制造商说明书对加样系统消毒。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 4833-2。