🦠 水中的微囊藻毒素（蓝藻毒素）——固相萃取与高效液相色谱法，238 nm 紫外检测
三句话速览
把含蓝藻生物量的水过滤，生物量用甲醇/水 75/25 混合液提取，滤液和经处理的水则在 C-18 固相萃取柱上富集；微囊藻毒素用含 0。该检测依据 ISO 20179:2005；标准溶液的范围：每种微囊藻毒素 0.2；0.4；1.0；2.0 和 3.0 µg/ml（标准表 3）。整个程序共 10 个步骤（合计约 55 分钟）；主要用于：水源发生蓝藻水华期间对供人饮用水的控制（《法律公报》2026 年第 748 项：微囊藻毒素-LR 的参数值为 1.0 µg/l）、来自地表水源的原水——易发生水华的湖泊和拦河水库、就蓝藻毒素的去除评价水处理的效能。
要点速览
- 标准: ISO 20179:2005
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 55 分钟
- 已验证的分析物: MCYST-RR、MCYST-YR、MCYST-LR；其他结构变体——可以测出，但无法明确鉴定（缺少市售标准品、峰共流出）
- 基质: 含生物量的原水以及经处理的水（例如自来水）
- 检测: 反相高效液相色谱配 238 nm 的紫外/二极管阵列检测（替代方式为质谱——标准附录 A）
概述
微囊藻毒素是由蓝藻产生的毒素；标准开篇即警告它们对人有强烈的肝毒性。各变体的名称来自两个可变的氨基酸：MCYST-LR 含亮氨酸（L）和精氨酸（R），MCYST-RR 含两个精氨酸单元，MCYST-YR 含酪氨酸（Y）和精氨酸。对微囊藻毒素-LR，世界卫生组织提出了水中 1 µg/l 的阈值；标准指出，在用固相萃取法富集样品之后可以对这一数值进行控制。
ISO 20179:2005 描述在含生物量的原水以及在自来水等经处理的水中测定并定量微囊藻毒素的方法。本方法对三个变体已验证：MCYST-RR、MCYST-YR 和 MCYST-LR。它也可用于这些微囊藻毒素的若干其他结构变体，但无法对它们作出明确鉴定——缺少市售标准品，而且峰会共流出。标准在附录 A 中允许以质谱作为替代检测。
在波兰，微囊藻毒素-LR 是供人饮用水的化学参数：卫生部长 2026 年 5 月 22 日的条例（《法律公报》2026 年第 748 项）规定参数值为 1.0 µg/l，并附注「parametr ten mierzy się jedynie w przypadku potencjalnych zakwitów w źródle wody (zwiększenie gęstości komórek sinicowych lub potencjał tworzenia zakwitu)」[中文：该参数仅在水源可能出现水华时测定（蓝藻细胞密度增加或具有形成水华的潜势）]，并把容许的测量不确定度定为参数值的 30 %。该条例没有为这一参数指明参照方法——它只为微生物参数列出参照方法。ISO 20179:2005 本身未被采用进波兰标准集合；第一版仍然有效，并已由 ISO 在 2026 年 4 月 7 日结束的系统复审中确认（阶段 90.93「国际标准经确认」）。该标准的生命周期卡片中既没有记录替代标准，也没有记录勘误（Cor/Amd）。
本条目中的波兰文标题是我们的工作译名，而不是官方标题：该标准未被采用进波兰标准集合。
方法原理
含有蓝藻物质（生物量）的水样先行过滤。所截留的生物量另行用甲醇/水混合液提取，提取液经过滤、稀释并用固相萃取法（SPE）净化；分离生物量之后的滤液则按洁净水样处理。洁净水样（例如自来水）直接在 SPE 柱上富集。微囊藻毒素用含 0.1 %（体积分数）三氟乙酸（TFA）的甲醇/水 90/10（v/v）混合液从柱上洗脱，并以反相高效液相色谱（RP-HPLC）配 238 nm 波长的紫外/二极管阵列检测进行定量测定。
应用领域
- 水源发生蓝藻水华期间对供人饮用水的控制（《法律公报》2026 年第 748 项：微囊藻毒素-LR 的参数值为 1.0 µg/l）
- 来自地表水源的原水——易发生水华的湖泊和拦河水库
- 就蓝藻毒素的去除评价水处理的效能
- 在管网中输配的自来水（洁净水样直接在 SPE 上富集）
- 在测定 MCYST-LR 的同时测定 MCYST-RR 和 MCYST-YR 变体——本方法对这三者都已验证
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 已验证的分析物 | MCYST-RR、MCYST-YR、MCYST-LR；其他结构变体——可以测出，但无法明确鉴定（缺少市售标准品、峰共流出） |
| 基质 | 含生物量的原水以及经处理的水（例如自来水） |
| 检测 | 反相高效液相色谱配 238 nm 的紫外/二极管阵列检测（替代方式为质谱——标准附录 A） |
| 参照数值 | 按世界卫生组织的建议为 MCYST-LR 1 µg/l，经 SPE 富集后可以达到；在波兰参数值为 1.0 µg/l，容许测量不确定度为 30 % |
| 对 SPE 柱的要求 | 每种微囊藻毒素的容量至少 100 µg；上样各 0.05 µg 时，MCYST-LR 的回收率不低于 80 %，MCYST-RR 和 -YR 不低于 70 % |
| 标准溶液的范围 | 每种微囊藻毒素 0.2；0.4；1.0；2.0 和 3.0 µg/ml（标准表 3） |
标准
- 标准编号
- ISO 20179:2005
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Oznaczanie mikrocystyn — Metoda z zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją w nadfiolecie (UV)
- 标准名称（英语）
- Water quality — Determination of microcystins — Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection
分步操作程序
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样品的采取
按 ISO 20179 所援引的标准采样：ISO 5667-4（天然湖泊与人工湖）以及 ISO 5667-5（来自水处理站和管网的饮用水）。配制试剂应使用符合 ISO 3696 的 3 级水。
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减少在塑料上的损失
在整个分析过程中，凡有可能之处都应避免塑料制部件（吸管、软管、塑料柱）——微囊藻毒素会吸附在其壁上，结果会因损失而偏低。
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生物量的分离
把含蓝藻物质的水样经截留能力 1—2 µm（直径至 47 mm）的玻璃纤维滤膜过滤。本步骤仅涉及含浮游植物的样品；滤液此后按洁净水样处理。
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生物量的提取
把滤膜上的生物量另行用甲醇/水 75/25（v/v）混合液提取。为破碎细胞并分散悬浮液，标准规定采用超声探头（约 60 W、约 20 kHz）、超声波清洗槽、水平振荡器以及至少 4000 min⁻¹ 且相对离心力至少 10 000 g 的离心机。提取液应过滤并稀释。
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在 SPE 柱上富集
把样品滤液以及洁净水样（例如自来水）从 500 ml 储液器经真空泵辅助通过 C-18 SPE 柱。该柱对每种微囊藻毒素的容量必须至少为 100 µg，并使 MCYST-LR 的回收率至少为 80 %、MCYST-RR 和 -YR 至少为 70 %。
-
冲洗与洗脱
用甲醇/水 20/80（v/v）混合液冲洗柱，并用加有 0.1 %（体积分数）TFA 的甲醇/水 90/10（v/v）混合液把微囊藻毒素洗脱下来。洗脱液浓缩后重新溶于甲醇/水 20/80（v/v）混合液中。
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标准品的配制
以分光光度法确定每种储备标准品的准确浓度：溶于纯甲醇，用 1 cm 石英比色皿以甲醇作参比记录 220—250 nm 的吸收曲线，然后按式 (1) 以 ε = 39 800 l/(mol·cm) 和摩尔质量 994（LR）、1044（YR）或 1037 g/mol（RR）计算浓度。由 2.5 µg/ml 的混合储备液（保存于 −16 °C 以下）配制五个标准溶液：0.2；0.4；1.0；2.0 和 3.0 µg/ml。
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色谱分离
分离在反相体系中进行。标准给出一个示例性梯度（表 1，标准中称之为「an example」；这是在自有色谱柱上进行优化的出发点，而不是一项要求）：0 min 30 % A / 70 % B，10 min 35/65，40 min 70/30，42—44 min 100/0，46—55 min 回到 30/70；流速按色谱柱为 0.3—1.0 ml/min（A——含 TFA 的乙腈，B——含 TFA 的水；两种流动相使用前均须脱气）。
-
检测与结果的计算
以 238 nm 的紫外/二极管阵列检测对微囊藻毒素作定量测定，把峰面积对照标准曲线。结果与微囊藻毒素-LR 1 µg/l 的数值相对照（世界卫生组织；在波兰参数值为 1.0 µg/l）。
-
方法的控制
同时检验一个加标样品：三种微囊藻毒素各为 1 µg/l 的对照溶液，由 200 µl 混合储备液用自来水或不含毒素的湖水稀释至 500 ml 配制。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 配紫外或二极管阵列检测器的 HPLC 系统 | 反相色谱柱，238 nm 检测，流动相流速 0.3—1.0 ml/min，按色谱柱选定 | — |
| 固相萃取装置 | 500 ml SPE 储液器配柱接头，以及 SPE 用真空泵 | — |
| 实验室离心机 | 至少 4000 min⁻¹ 且相对离心力至少 10 000 g；因提取溶剂易燃，建议采用防爆型离心机 | — |
| 超声探头与超声波清洗槽 | 功率约 60 W、频率约 20 kHz 的探头——用于破碎蓝藻细胞 | — |
| 玻璃纤维滤膜 | 截留能力 1—2 µm，直径不大于 47 mm；仅在样品含浮游植物时需要 | — |
| 可调水平振荡器 | 仅在分析含浮游植物的样品时需要 | — |
| 配 1 cm 石英比色皿的分光光度计 | 用于由 220—250 nm 的吸收曲线确定标准品的准确浓度 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 甲醇 | 67-56-1 | HPLC 级；提取液、标准品溶剂和 SPE 洗脱液的组分 |
| 乙腈 | 75-05-8 | HPLC 级；流动相 A 的基础（800 ml 乙腈 + 500 µl TFA，用乙腈定容至 1000 ml；在室温下可稳定约 3 周） |
| 三氟乙酸（TFA） | 76-05-1 | 流动相的添加剂（每 1000 ml 加 500 µl）以及 SPE 洗脱液的添加剂（0.1 % 体积分数） |
| 甲醇/水 75/25（v/v）提取液 | — | 用于从滤膜上截留的蓝藻生物量中提取微囊藻毒素 |
| SPE 洗脱液——含 0.1 %（体积分数）TFA 的甲醇/水 90/10（v/v） | — | 用于把微囊藻毒素从 SPE 柱上洗脱下来 |
| 甲醇/水 20/80（v/v）溶液 | — | 用于稀释标准品、冲洗 SPE 柱以及重新溶解洗脱液的溶剂 |
| MCYST-LR、-YR 和 -RR 微囊藻毒素标准品 | — | 市售，安瓿装；储备液的准确浓度以分光光度法由甲醇中 220—250 nm 的吸收曲线确定，摩尔质量分别为 994、1044 和 1037 g/mol，238 nm 处的摩尔吸收系数为 39 800 l/(mol·cm) |
职业健康与安全
- 微囊藻毒素对人有强烈的肝毒性——标准把这一警告放在标题处；配制和使用标准溶液须戴手套、在通风柜中进行
- 含微囊藻毒素的实验室废物应单独收集，按高毒性化学废物处置；允许用浓次氯酸钠溶液（NaClO）长时间去污
- 该检验只能由受过相应培训的人员进行——标准把这一点列为绝对条件
- 甲醇和乙腈易燃且有毒，三氟乙酸有腐蚀性——须在通风柜中作业，佩戴手套和护目镜
- 因提取溶剂易燃，标准强烈建议采用防爆型离心机
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 ISO 20179:2005 — 《Water quality — Determination of microcystins — Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection》。
该方法的原理是什么？
含有蓝藻物质（生物量）的水样先行过滤。所截留的生物量另行用甲醇/水混合液提取，提取液经过滤、稀释并用固相萃取法（SPE）净化；分离生物量之后的滤液则按洁净水样处理。
测量范围和准确度是多少？
已验证的分析物：MCYST-RR、MCYST-YR、MCYST-LR；其他结构变体——可以测出，但无法明确鉴定（缺少市售标准品、峰共流出）；基质：含生物量的原水以及经处理的水（例如自来水）；检测：反相高效液相色谱配 238 nm 的紫外/二极管阵列检测（替代方式为质谱——标准附录 A）；参照数值：按世界卫生组织的建议为 MCYST-LR 1 µg/l，经 SPE 富集后可以达到；在波兰参数值为 1.0 µg/l，容许测量不确定度为 30 %。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 55 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
配紫外或二极管阵列检测器的 HPLC 系统、固相萃取装置、实验室离心机、超声探头与超声波清洗槽、玻璃纤维滤膜、可调水平振荡器、配 1 cm 石英比色皿的分光光度计。
该检测用于哪些场景？
水源发生蓝藻水华期间对供人饮用水的控制（《法律公报》2026 年第 748 项：微囊藻毒素-LR 的参数值为 1.0 µg/l）；来自地表水源的原水——易发生水华的湖泊和拦河水库；就蓝藻毒素的去除评价水处理的效能；在管网中输配的自来水（洁净水样直接在 SPE 上富集）；在测定 MCYST-LR 的同时测定 MCYST-RR 和 MCYST-YR 变体——本方法对这三者都已验证。
需要采取哪些安全防护措施？
微囊藻毒素对人有强烈的肝毒性——标准把这一警告放在标题处；配制和使用标准溶液须戴手套、在通风柜中进行；含微囊藻毒素的实验室废物应单独收集，按高毒性化学废物处置；允许用浓次氯酸钠溶液（NaClO）长时间去污；该检验只能由受过相应培训的人员进行——标准把这一点列为绝对条件；甲醇和乙腈易燃且有毒，三氟乙酸有腐蚀性——须在通风柜中作业，佩戴手套和护目镜；因提取溶剂易燃，标准强烈建议采用防爆型离心机。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 ISO 20179。