💊 化妆品微生物洁净度
按 ISO 17516 检验化妆品的微生物洁净度。测定微生物总数并检出致病菌（大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 17516:2014
- 类别: 制药与化妆品
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 8 天 1 小时 17 分钟–16 天 1 小时 17 分钟
- TAMC（一般产品）: ≤1 × 10³ CFU/g 或 mL
- TAMC（眼周、3 岁以下儿童、黏膜）: ≤1 × 10² CFU/g 或 mL
- 致病菌 — 0,1 g/mL 中不得检出: 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌
概述
微生物洁净度是化妆品的关键安全参数之一。PN-EN ISO 17516 标准规定了化妆品的微生物限值，确保产品不含过量微生物或指定的致病微生物，以免对产品质量或消费者安全造成不良影响。
标准划分了两类产品并规定不同限值。一般用途产品（身体乳、洗发水、沐浴露）中需氧嗜温菌数的可接受值为 ≤1×10³ CFU/g（或 mL）。用于眼周、3 岁以下儿童和黏膜的产品 — 限值收紧至 ≤1×10² CFU/g（或 mL）。两类产品均要求不得检出致病菌：大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌（0,1 g 或 0,1 mL 产品中）。
化妆品微生物检验按配套标准系列进行：ISO 21148（一般试验说明）、ISO 21149（需氧嗜温菌计数）、ISO 22717（铜绿假单胞菌）、ISO 22718（金黄色葡萄球菌）、ISO 18416（白色念珠菌）和 ISO 16212（酵母和霉菌）。这些方法规定了样品制备、培养基选择、培养条件和结果判读。
化妆品生产企业负责保证产品在整个保质期内的微生物洁净度。定期微生物检验是（EC）1223/2009 号化妆品法规所要求的质量保证体系的组成部分。
方法原理
试验是采取有代表性的化妆品样品，悬浮于稀释液（含可中和防腐剂作用的表面活性剂的胨盐缓冲液 — 如吐温 80、卵磷脂、硫代硫酸钠）中，随后接种于相应培养基。需氧菌总数（TAMC）用平板法（倾注或表面涂布）在胰酪大豆琼脂（TSA）上测定，30–35°C 培养 48–72 h。酵母和霉菌（TYMC）在含氯霉素的沙保罗琼脂上培养，20–25°C 培养 5–7 天。致病菌通过选择性培养基（麦康凯、十六烷基三甲基溴化铵、Baird-Parker、SDA）增菌检出，并以生化方法或 API/Vitek 试验确证。
应用领域
- 化妆品成品（面霜、润肤露、洗发水）质量控制
- 化妆品原料（植物提取物、花水）检验
- 包装和包装材料洁净度控制
- 生产环境监测（化妆品 GMP）
- 保质期评估中的微生物稳定性检验
- 生产线消毒和清洗工艺有效性验证
- 按（EC）1223/2009 号法规进行的安全评估
- 投诉检验 — 微生物污染原因分析
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| TAMC（一般产品） | ≤1 × 10³ CFU/g 或 mL |
| TAMC（眼周、3 岁以下儿童、黏膜） | ≤1 × 10² CFU/g 或 mL |
| 致病菌 — 0,1 g/mL 中不得检出 | 大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌 |
| 培养温度（细菌） | 30–35°C，48–72 h |
| 培养温度（真菌） | 20–25°C，5–7 天 |
| 取样量 | 1 g 或 1 mL（作 1:10 稀释） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 17516:2014
- 标准名称（波兰语）
- Kosmetyki — Mikrobiologia — Limity mikrobiologiczne
- 标准名称（英语）
- Cosmetics — Microbiology — Microbiological limits
分步操作程序
-
取样与样品制备
无菌取 1 g（或 1 mL）化妆品。转入装有 9 mL 含中和剂稀释液的均质袋中。
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均质
在拍击式均质器中均质（1–2 min，230 rpm）或剧烈振摇。制成均匀的 1:10 悬液。
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测定 TAMC（需氧嗜温菌）
取 1 mL 1:10 悬液接种于 TSA 平板（倾注或表面涂布法）。做平行样。30–35°C 培养 48–72 h。
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测定 TYMC（酵母和霉菌）
取 1 mL 1:10 悬液接种于 SDA + 氯霉素平板。20–25°C 培养 5–7 天。
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检出大肠埃希氏菌
取 1 mL 悬液转入 9 mL 麦康凯肉汤。30–35°C 培养 24–48 h。划线接种麦康凯琼脂。生化确证。
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检出铜绿假单胞菌
在十六烷基三甲基溴化铵肉汤中增菌，30–35°C，24–48 h。划线接种同名琼脂。确证（氧化酶 +、色素、API/Vitek）。
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检出金黄色葡萄球菌
在胰酪大豆肉汤中增菌，30–35°C，24–48 h。划线接种 Baird-Parker 琼脂。确证（凝固酶 +、过氧化氢酶 +）。
-
检出白色念珠菌
在沙保罗肉汤中增菌，30–35°C，48 h。划线接种 SDA 琼脂。确证（芽管试验、API AUX/ID32C）。
-
结果读取与计算
计数 TAMC 和 TYMC 平板上的菌落。计算 CFU/g = 菌落数 × 稀释倍数。评定致病菌检出/未检出。与 ISO 17516 限值比较。
-
报告与符合性评定
编制报告：TAMC、TYMC、致病菌（检出/未检出）。给出与 ISO 17516 的符合性评定。保存实验室记录。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| II 级生物安全柜 | Thermo Fisher MSC-Advantage、Esco Labculture、FASTER BH-EN | 25 000–60 000 PLN |
| 30–35°C 细菌培养箱 | Memmert IN110、Binder BD115、POL-EKO CLN 53 | 8 000–20 000 PLN |
| 20–25°C 真菌培养箱 | Memmert IPP110、Binder KB115，帕尔贴制冷 | 10 000–25 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 3870ELV、Systec VX-75，121°C / 15 min | 20 000–60 000 PLN |
| 分析天平（0,01 g） | Mettler Toledo ME204、Sartorius Quintix 224 | 5 000–12 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400、BagMixer 400 | 10 000–25 000 PLN |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 300/500、BZG 30 Koloniezähler | 5 000–20 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 胰酪大豆琼脂（TSA） | 91079-40-2 | 测定 TAMC 用培养基，成品平板或配制用粉剂，500 g 装 |
| 含氯霉素的沙保罗琼脂（SDA） | — | 测定酵母和霉菌（TYMC）用培养基，20–25°C 培养 5–7 天 |
| 含中和剂的稀释缓冲液 | — | 胨盐溶液 + 吐温 80（3%）+ 卵磷脂（0,3%）+ 硫代硫酸钠（0,5%）— 中和防腐剂 |
| 麦康凯琼脂 | — | 检出大肠埃希氏菌和肠杆菌的选择性培养基 |
| 十六烷基三甲基溴化铵琼脂 | — | 检出铜绿假单胞菌的选择性培养基 |
| Baird-Parker 琼脂 | — | 检出金黄色葡萄球菌的选择性培养基，含蛋黄乳液和亚碲酸钾 |
| 沙保罗葡萄糖琼脂（SDA） | — | 检出白色念珠菌用培养基，含氯霉素 |
| 均质袋 | — | 无菌滤膜均质袋，样品均质用，一次性 |
职业健康与安全
- 微生物操作 — 必须在 II 级生物安全柜中进行，BSL-1/BSL-2 级别
- 致病菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌）— 有感染风险，须戴丁腈手套并做手部消毒
- 生物废物须高压灭菌后再废弃（121°C，15 min）
- 用 70% 酒精或次氯酸钠溶液对工作台面消毒
- 必须佩戴护目镜和实验服
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 17516:2014 — 《Cosmetics — Microbiology — Microbiological limits》。
该方法的原理是什么？
试验是采取有代表性的化妆品样品，悬浮于稀释液（含可中和防腐剂作用的表面活性剂的胨盐缓冲液 — 如吐温 80、卵磷脂、硫代硫酸钠）中，随后接种于相应培养基。需氧菌总数（TAMC）用平板法（倾注或表面涂布）在胰酪大豆琼脂（TSA）上测定，30–35°C 培养 48–72 h。
测量范围和准确度是多少？
TAMC（一般产品）：≤1 × 10³ CFU/g 或 mL；TAMC（眼周、3 岁以下儿童、黏膜）：≤1 × 10² CFU/g 或 mL；致病菌 — 0,1 g/mL 中不得检出：大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌；培养温度（细菌）：30–35°C，48–72 h。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 8 天 1 小时 17 分钟–16 天 1 小时 17 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
II 级生物安全柜、30–35°C 细菌培养箱、20–25°C 真菌培养箱、实验室高压灭菌器、分析天平（0,01 g）、拍击式均质器、菌落计数器。核心仪器的参考价格（II 级生物安全柜）：25 000–60 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
化妆品成品（面霜、润肤露、洗发水）质量控制；化妆品原料（植物提取物、花水）检验；包装和包装材料洁净度控制；生产环境监测（化妆品 GMP）；保质期评估中的微生物稳定性检验；生产线消毒和清洗工艺有效性验证；按（EC）1223/2009 号法规进行的安全评估；投诉检验 — 微生物污染原因分析。
需要采取哪些安全防护措施？
微生物操作 — 必须在 II 级生物安全柜中进行，BSL-1/BSL-2 级别；致病菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌）— 有感染风险，须戴丁腈手套并做手部消毒；生物废物须高压灭菌后再废弃（121°C，15 min）；用 70% 酒精或次氯酸钠溶液对工作台面消毒；必须佩戴护目镜和实验服。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 17516。