🍄 真菌毒素 — 黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A

食品化学 PN-EN 14123 / PN-EN 15851

采用免疫亲和柱（IAC）净化结合 HPLC-FLD 检测测定食品中的真菌毒素（黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2 及赭曲霉毒素 A）。

概述

真菌毒素是霉菌（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）的有毒次生代谢产物，对人和动物健康构成严重威胁。黄曲霉毒素 B1 是已知最强的天然致癌物（IARC 1 类），赭曲霉毒素 A 具肾毒性并可能致癌（2B 类）。欧盟法规（欧共体 1881/2006 号法规、欧盟 2023/915 号法规）规定了严格的食品限量：黄曲霉毒素 B1 为 2–12 µg/kg，黄曲霉毒素总量 4–15 µg/kg，赭曲霉毒素 A 为 3–10 µg/kg。

基于 EN 14123（黄曲霉毒素）和 EN 15851（赭曲霉毒素 A）标准的分析方法包括：用乙腈/水（或甲醇/水）混合液提取样品、经免疫亲和柱（IAC）净化，并用带荧光检测器（FLD）的 HPLC 测定。IAC 柱内含可特异性结合目标真菌毒素的单克隆抗体，净化选择性很高。

黄曲霉毒素 B1 和 G1 需要柱后荧光衍生（碘或钴溴化、光化学 UV，或电化学 KOBRA 池）以增强荧光信号。黄曲霉毒素 B2 和 G2 本身即有荧光。赭曲霉毒素 A 具有很强的天然荧光，无需衍生。

也可采用 LC-MS/MS 检测（无需衍生），可在一次检验中同时测定多种真菌毒素（黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、T-2/HT-2）（多毒素法）。VICAM Myco6in1+ 或 R-Biopharm EASI-EXTRACT 柱可同时净化多种真菌毒素。

方法原理

提取：样品（25–50 g）用乙腈/水（80:20 v/v）或甲醇/水（80:20）混合液加 NaCl 提取。IAC 净化：稀释后的提取液过免疫亲和柱（如 VICAM AflaOchra、R-Biopharm EASI-EXTRACT）。真菌毒素选择性地结合到柱内抗体上，基质杂质则被水洗去。用甲醇（1–3 mL）洗脱真菌毒素。HPLC-FLD 检测：洗脱液进 C18 色谱柱。黄曲霉毒素经衍生（KOBRA 池 — 电化学溴化）。荧光检测：λex 365 nm / λem 435 nm（黄曲霉毒素），λex 333 nm / λem 460 nm（赭曲霉毒素 A）。依据校准曲线定量。

应用领域

• 坚果、谷物、香辛料中黄曲霉毒素官方控制（欧盟 2023/915 号法规）
• 谷物、咖啡、葡萄酒、可可中赭曲霉毒素 A 测定
• 饲料和饲料原料控制（黄曲霉毒素 B1）
• 婴幼儿食品检验（限量最低：0,10 µg/kg）
• 乳品监测 — 黄曲霉毒素 M1（限量 0,050 µg/kg）
• 干果控制（无花果、葡萄干、杏干）
• 进口原料的 BRC/IFS 认证

关键参数

标准

标准编号

PN-EN 14123:2008 / PN-EN 15851:2010

标准名称（波兰语）

Żywność — Oznaczanie aflatoksyn B1, B2, G1, G2 i ochratoksyny A z zastosowaniem kolumnek immunopowinowactwa i HPLC

标准名称（英语）

Foodstuffs — Determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and ochratoxin A using immunoaffinity column clean-up and HPLC

分步操作程序

1. 样品制备

   将样品粉碎/均质（至少 100 g）。称取 25 g 于锥形瓶中。

   ⏱ 时间: 10 min

2. 提取

   加入 5 g NaCl 和 100 mL 乙腈/水（80:20）。在摇床上剧烈振荡 30 min。

   ⏱ 时间: 30 min

3. 过滤与稀释

   用折叠滤纸过滤。取部分滤液（如 10 mL）用 PBS 稀释至 50 mL（使 MeCN 浓度降至 < 25%）。

   ⏱ 时间: 10 min

4. IAC 净化

   将稀释提取液以 1–2 滴/秒的流速过 IAC 柱。真菌毒素与抗体结合。

   ⏱ 时间: 10–15 min

5. 洗涤

   用 20 mL 去离子水洗柱（除去基质杂质）。抽真空 30 s。

   ⏱ 时间: 5 min

6. 洗脱

   用 1,5 mL 甲醇洗脱真菌毒素（流速 1 滴/2 秒）。收集于 HPLC 小瓶。用 N₂ 吹干后以流动相复溶。

   ⏱ 时间: 10 min

7. HPLC 进样

   进样 50–100 µL 至 C18 色谱柱。流动相：H₂O/MeCN/MeOH 加乙酸。梯度或等度洗脱。

   ⏱ 时间: 20–30 min

8. FLD 检测

   配 KOBRA 池的荧光检测：黄曲霉毒素 λex 365 / λem 435 nm，赭曲霉毒素 A λex 333 / λem 460 nm。

   ⏱ 时间: HPLC 运行期间

9. 定量

   依据校准曲线（5–7 点）计算浓度。计入稀释倍数和取样量。

   ⏱ 时间: 15 min

10. 质量控制

    每批：空白、加标样品、CRM（FAPAS/BIPEA）。黄曲霉毒素回收率 70–110%，赭曲霉毒素 70–110%。参加能力验证。

    ⏱ 时间: 60 min

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 黄曲霉毒素 — 强致癌物（IARC 1 类）。佩戴双层手套，在专用区域操作。
• 真菌毒素标准品 — 有毒。于冰箱（-20°C）保存。在通风柜中配制溶液。
• 乙腈 — 易燃且有毒（H225、H302、H312、H332）。在通风柜中操作。
• 甲醇 — 易燃且有毒（H225、H301、H311、H331）。吸入和吞咽均有毒。
• 黄曲霉毒素去污 — 次氯酸钠溶液（5% NaOCl）可中和表面上的黄曲霉毒素。
• 含真菌毒素的废物 — 单独收集并化学中和后再处置。

常见问题