🦠 食品中的嗜温乳酸菌——MRS琼脂（pH 5.7）平板法，30 °C，72 h
三句话速览
把1 ml样品或稀释液分别倾注接种于两块平板，倒入约15 ml pH 5。该检测依据 PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998)；培养：30 °C ± 1 °C，72 h ± 3 h，平板倒置；避免琼脂干燥（抑制作用增强）。整个程序共 7 个步骤；主要用于：发酵产品：酸奶、开菲尔、干酪、酸渍菜、发酵蔬菜汁、成熟香肠——发酵剂培养物和活菌数的控制、益生菌和补充剂（Lactobacillus活细胞数）、模拟消化道中的存活性研究、乳酸菌引起产品腐败的评价（真空包装肉、色拉、饮料）。
要点速览
- 标准: PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 7
- 培养: 30 °C ± 1 °C，72 h ± 3 h，平板倒置；避免琼脂干燥（抑制作用增强）
- 培养基: MRS琼脂 pH 5.7 ± 0.1（25 °C）；121 °C 15 min；约47 °C时每皿约15 ml
- 计数: 两个连续稀释度中菌落 < 300个的平板，至少一块平板 ≥ 15个菌落
概述
ISO 15214:1998规定了通过计数在30 °C下培养3天后在固体培养基中生长的菌落来测定活的嗜温乳酸菌数量的水平法；它适用于供人食用的产品和饲料。某些产品中存在需要其他温度的嗜冷或嗜热乳酸菌，而并非所有乳酸菌都能在pH 5.7的MRS琼脂上生长（有些生长不良）。嗜温乳酸菌定义为在试验条件下于30 °C在固体选择性培养基（pH 5.7的MRS）中形成菌落的细菌。缓冲蛋白胨水并不总能使乳酸菌良好复苏（附录A）。在波兰的科学文献中（如模拟消化道中Lactobacillus菌株存活性的研究，ŻNTJ 2015），细菌细胞数“按PN-ISO 15214:2002在MRS固体培养基上”测定；在教学中（UWM，瓦尔米亚－马祖里大学），酸奶和发酵蔬菜汁按每份0.1 ml稀释液接种于MRS平板，并在带产气袋的厌氧容器中培养。
方法原理
制备两块用规定量的液体样品或初始悬液倾注接种（或在必要时表面涂布接种）pH 5.7的MRS琼脂的平板，以及由十倍稀释液制备的后续成对平板；平板在30 °C下培养72 h；每g或每ml的细菌数由选定平板上的菌落数计算，必要时经确证后计算。MRS（de Man、Rogosa、Sharpe）培养基每1000 ml：酪蛋白水解物10 g、肉浸膏10 g、酵母浸膏4 g、柠檬酸三铵2 g、乙酸钠5 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、MnSO₄·4H₂O 0.05 g、K₂HPO₄ 2 g、葡萄糖20 g、Tween 80 1.08 g、琼脂12–18 g；各组分经煮沸溶解，调节pH使灭菌后在25 °C下为5.7 ± 0.1（容差 ± 0.1，以免pH降到5.6以下），121 °C灭菌15 min并冷却至约47 °C（保存的培养基在沸水浴中熔化并冷却至47 °C）。存在酵母菌大量污染风险时（如干香肠）加入山梨酸：把1.4 g溶于约10 ml 1 mol/l NaOH中，经过滤除菌，加入冷却至47 °C的1000 ml MRS中，最终pH 5.7 ± 0.1。允许使用市售的现成培养基，但其组成和pH可能不同并给出不同的结果。允许采用表面涂布接种并作厌氧或微需氧培养（烛缸）以及双层培养基。某些Leuconostoc形成大的黏液状菌落，妨碍其他菌落的生长（结果偏低）；由于在某些产品中MRS上可能长出其他微生物，故用简单试验（革兰氏染色、过氧化氢酶）确证菌落——并在报告中注明。计算：N = ΣC / [V·(n₁ + 0.1·n₂)·d]，修约至两位有效数字；由样品／初始悬液制备的平板上菌落 < 15个时给出估算数（算术平均值y；液体产品NE = y，其余为y/d）。
应用领域
- 发酵产品：酸奶、开菲尔、干酪、酸渍菜、发酵蔬菜汁、成熟香肠——发酵剂培养物和活菌数的控制
- 益生菌和补充剂（Lactobacillus活细胞数）、模拟消化道中的存活性研究
- 乳酸菌引起产品腐败的评价（真空包装肉、色拉、饮料）
- 饲料和青贮（接种剂）、植物原料
- 乳品业中MRS培养基和培养物的质量控制
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养 | 30 °C ± 1 °C，72 h ± 3 h，平板倒置；避免琼脂干燥（抑制作用增强） |
| 培养基 | MRS琼脂 pH 5.7 ± 0.1（25 °C）；121 °C 15 min；约47 °C时每皿约15 ml |
| 计数 | 两个连续稀释度中菌落 < 300个的平板，至少一块平板 ≥ 15个菌落 |
| 结果 | N = ΣC/[V(n₁ + 0.1n₂)d]，两位有效数字，以每g或每ml的1.0–9.9 × 10ⁿ表示；菌落 < 15个时为估算数 |
| 抗酵母菌添加物 | 山梨酸1.4 g/l（溶于10 ml 1 mol/l NaOH，经过滤） |
| 变体 | 表面涂布接种 + 厌氧／微需氧培养（烛缸）；双层MRS |
| 确证（可选） | 革兰氏染色、过氧化氢酶——用于MRS上会长出其他微生物的产品 |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby mezofilnych bakterii fermentacji mlekowej — Metoda płytkowa w temperaturze 30 stopni C
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C
分步操作程序
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培养基
把MRS各组分经煮沸溶解，调节pH使灭菌后在25 °C下为5.7 ± 0.1，121 °C灭菌15 min并冷却至约47 °C（保存的培养基在沸水浴中熔化并冷却至47 °C）；有酵母菌风险时加入过滤后的山梨酸溶液（每1 l用1.4 g溶于约10 ml 1 mol/l NaOH）。
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样品和稀释液
按ISO 6887-1制备初始悬液和十倍稀释液；样品应具代表性且在运输中未受损坏。
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接种
向两块无菌平板中各移入1 ml液体样品或初始悬液，向后续各对平板中各移入1 ml后续稀释液（每个稀释度换新移液管）；数量大时只接种计数所需的稀释液。
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倾注
向每块平板倒入约15 ml温度约47 °C的MRS，小心混匀并静置凝固（也可表面涂布接种并作厌氧或微需氧培养，或用双层MRS）。
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培养
把平板倒置在30 °C下培养72 h ± 3 h，防止琼脂干燥。
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计数与确证
在两个连续稀释度中菌落 < 300个、且至少一块 ≥ 15个的平板上计数；考虑可能出现的Leuconostoc黏液状菌落；必要时用革兰氏染色和过氧化氢酶试验确证菌落（在报告中注明）。
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计算
N = ΣC/[V(n₁ + 0.1n₂)d]（如(168 + 215 + 14 + 25)/[1·(2 + 0.2)·10⁻²] = 19 182 → 1.9 × 10⁴/g）；菌落 < 15个时——估算数NE = y（液体）或y/d（其他）；结果以每g或每ml的1.0–9.9 × 10ⁿ表示。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱30 °C ± 1 °C | — | |
| 水浴47 °C ± 2 °C和沸水浴 | 培养基的冷却和熔化 | — |
| 90–100 mm培养皿、10 ml（0.5 ml）和1 ml（0.1 ml）移液管 | — | |
| pH计（0.01；25 °C下 ± 0.1 pH） | 调节pH 5.7 | — |
| 高压灭菌器和干燥箱；可选厌氧罐／烛缸 | 按ISO 7218 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| MRS琼脂（酪蛋白水解物10 g、肉浸膏10 g、酵母浸膏4 g、柠檬酸三铵2 g、乙酸钠5 g、MgSO₄·7H₂O 0.2 g、MnSO₄·4H₂O 0.05 g、K₂HPO₄ 2 g、葡萄糖20 g、Tween 80 1.08 g、琼脂12–18 g/l），pH 5.7 | — | 乳酸菌的固体选择性培养基 |
| 山梨酸1.4 g + 1 mol/l NaOH（约10 ml），经过滤除菌 | — | 抑制酵母菌（干制品、香肠） |
| 按ISO 6887-1的稀释液 | — | 初始悬液和稀释液（缓冲蛋白胨水并不总能使LAB复苏） |
| 革兰氏染色试剂、过氧化氢酶试验用H₂O₂ | — | 菌落的可选确证 |
职业健康与安全
- 乳酸菌不是致病菌，但食品样品可能含有致病菌——须遵守良好微生物操作规范
- 热琼脂（47 °C）和沸水浴——防止烫伤；1 mol/l NaOH——有腐蚀性
- 带蜡烛或产气装置的厌氧罐——小心明火和氢气
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 15214:2002 (ISO 15214:1998) — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of mesophilic lactic acid bacteria — Colony-count technique at 30 °C》。
该方法的原理是什么？
制备两块用规定量的液体样品或初始悬液倾注接种（或在必要时表面涂布接种）pH 5.7的MRS琼脂的平板，以及由十倍稀释液制备的后续成对平板；平板在30 °C下培养72 h；每g或每ml的细菌数由选定平板上的菌落数计算，必要时经确证后计算。
测量范围和准确度是多少？
培养：30 °C ± 1 °C，72 h ± 3 h，平板倒置；避免琼脂干燥（抑制作用增强）；培养基：MRS琼脂 pH 5.7 ± 0.1（25 °C）；121 °C 15 min；约47 °C时每皿约15 ml；计数：两个连续稀释度中菌落 < 300个的平板，至少一块平板 ≥ 15个菌落；结果：N = ΣC/[V(n₁ + 0.1n₂)d]，两位有效数字，以每g或每ml的1.0–9.9 × 10ⁿ表示；菌落 < 15个时为估算数。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 7 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱30 °C ± 1 °C、水浴47 °C ± 2 °C和沸水浴、90–100 mm培养皿、10 ml（0.5 ml）和1 ml（0.1 ml）移液管、pH计（0.01；25 °C下 ± 0.1 pH）、高压灭菌器和干燥箱；可选厌氧罐／烛缸。
该检测用于哪些场景？
发酵产品：酸奶、开菲尔、干酪、酸渍菜、发酵蔬菜汁、成熟香肠——发酵剂培养物和活菌数的控制；益生菌和补充剂（Lactobacillus活细胞数）、模拟消化道中的存活性研究；乳酸菌引起产品腐败的评价（真空包装肉、色拉、饮料）；饲料和青贮（接种剂）、植物原料；乳品业中MRS培养基和培养物的质量控制。
需要采取哪些安全防护措施？
乳酸菌不是致病菌，但食品样品可能含有致病菌——须遵守良好微生物操作规范；热琼脂（47 °C）和沸水浴——防止烫伤；1 mol/l NaOH——有腐蚀性；带蜡烛或产气装置的厌氧罐——小心明火和氢气。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 15214。