🦠 食品中的Listeria monocytogenes（单核细胞增生李斯特氏菌）和Listeria spp.（李斯特氏菌属）——ALOA琼脂（Ottaviani-Agosti）计数法
三句话速览
取0.1 ml（数量低时取1 ml涂布于大平板）初始悬液和稀释液表面涂布于Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂，在37 °C下培养24 h ± 2 h并再培养24 h；带混浊晕圈的蓝绿色菌落（L。该检测依据 PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017)；培养基：Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂（ALOA）；组成和制法——附录B；要求按ISO 11133。整个程序共 6 个步骤；主要用于：即食食品中L. monocytogenes 100 CFU/g的安全判据——第2073/2005号条例（欧共体）的参比方法（第1.2和1.3类）、干酪和乳制品、即食的腌制肉和肉制品、熏鱼、色拉、保质期长的冷藏产品、生产即食食品企业中的环境样品（表面、设备）——把Listeria spp.作为指标进行监测。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 培养基: Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂（ALOA）；组成和制法——附录B；要求按ISO 11133
- 培养: 37 °C ± 1 °C；24 h ± 2 h并再加24 h ± 2 h，平板倒置
- 接种物: 90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板或3 × 90 mm平板1 ml（须做双份）
概述
ISO 11290-2:2017规定了在供人食用和动物饲用的产品以及来自食品生产和流通的环境样品中对L. monocytogenes和Listeria spp.（包括L. monocytogenes）计数的水平法；某些新近描述的Listeria菌种可能无法用该方法计数或确证。第二版取代了带修改单A1:2004的ISO 11290-2:1998；主要变化有：初始悬液改用缓冲蛋白胨水或半Fraser肉汤（加或不加添加剂）以及ISO 6887中的稀释液、取消复苏步骤、把显微镜、过氧化氢酶和CAMP试验改为可选、新的性能特性以及把Listeria spp.的计数纳入范围。这些变化被认定为重大（ISO 17468），但对方法的性能特性没有显著影响。委员会第2073/2005号条例（欧共体）指明EN/ISO 11290-2为即食食品中100 CFU/g安全判据（其中L. monocytogenes可能生长或不可能生长；5件样品方案，c = 0）的参比方法。Listeria为革兰氏阳性短杆菌，不形成芽孢和荚膜，兼性厌氧且嗜冷，在20–25 °C下有动力，过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性；L. monocytogenes在−2 °C至45 °C以及pH 4.4–9下生长，而李斯特氏菌病的病死率为20–30 %——检验须在生物安全2级的实验室中进行，孕妇和细胞免疫低下者不应接触培养物。
方法原理
计数需要连续五个阶段（流程图见附录A）：在适合样品的稀释液中制备初始悬液；把规定量的液体样品或初始悬液以及必要时的十倍稀释液表面涂布于Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂；在37 °C下培养并在24 h以及再过24 h后判定；用形态学和生化试验确证推定菌落；计算每g、每ml、每cm²或每件采样器具的菌数。初始悬液的稀释液用缓冲蛋白胨水或ISO 6887中的其他稀释液；当对同一样品同时按ISO 11290-1作检出时，可使用半Fraser肉汤（选择性因子最好在用于计数的接种之后加入；使用加有添加剂的半Fraser时应在45 min内接种平板）。小平板（90 mm）接种0.1 ml；数量低时把检出限降低十倍，检验涂布于大平板（140 mm）或三块小平板上的1 ml（仅使用初始悬液时须做双份）；接种物用涂布棒迅速涂开而不触及边缘，静置约15 min使其吸收。平板倒置于37 °C培养24 h ± 2 h并再培养24 h ± 2 h。L. monocytogenes形成周围有混浊（乳光）区的蓝绿色菌落（L. ivanovii亦然；经酸胁迫的菌株晕圈可能很弱或没有；PIPLC活性缓慢的罕见菌株在 > 4天后才显现）；Listeria spp.——蓝绿色，带或不带晕圈（其他微生物也可能形成蓝色菌落——附录C）。计数特征菌落 < 150个的平板（140 mm上 < 360个），而在混合培养或晕圈大而相互重叠时——< 100个（< 240个）。确证时从每块平板取5个代表各种类型的菌落，转接到非选择性培养基（血琼脂、营养琼脂、TSYEA）上并在37 °C下培养18–24 h。对L. monocytogenes的必做试验：β-溶血 +、L-鼠李糖 +、D-木糖 −；可选试验：显微镜下形态（细而短的杆菌／球杆菌）、过氧化氢酶 +、25 °C下动力 +、CAMP试验 +；罕见的非溶血菌株需要附加试验（革兰氏染色、过氧化氢酶、动力、CAMP、PCR）。在验证适用性后，允许使用微型生化鉴定条和按ISO 7218的替代程序。
应用领域
- 即食食品中L. monocytogenes 100 CFU/g的安全判据——第2073/2005号条例（欧共体）的参比方法（第1.2和1.3类）
- 干酪和乳制品、即食的腌制肉和肉制品、熏鱼、色拉、保质期长的冷藏产品
- 生产即食食品企业中的环境样品（表面、设备）——把Listeria spp.作为指标进行监测
- 饲料和原料；需要Listeria数量的货架期试验（挑战试验）
- 由半Fraser肉汤中的同一份悬液同时作检出（ISO 11290-1）和计数的联合检验
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养基 | Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂（ALOA）；组成和制法——附录B；要求按ISO 11133 |
| 培养 | 37 °C ± 1 °C；24 h ± 2 h并再加24 h ± 2 h，平板倒置 |
| 接种物 | 90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板或3 × 90 mm平板1 ml（须做双份） |
| 计数 | 特征菌落 < 150个（90 mm）／< 360个（140 mm）；混合培养：< 100个／< 240个 |
| 确证 | 每块平板5个菌落；必做β-溶血 +、鼠李糖 +、木糖 −；可选过氧化氢酶、25 °C下动力、CAMP、显微镜检查 |
| 法定判据 | 即食食品中100 CFU/g（n = 5，c = 0）——第2073/2005号条例（欧共体） |
| 结果 | CFU/g、CFU/ml、CFU/cm²或每件采样器具 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i innych Listeria spp. — Część 2: Metoda oznaczania liczby
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method
分步操作程序
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样品与悬液
按ISO 6887（表面则按ISO 18593）制备样品；初始悬液在缓冲蛋白胨水或ISO 6887的其他稀释液中配制，当同时按ISO 11290-1作检出时则在半Fraser肉汤中配制（添加剂在接种之后加入；加有添加剂时应在45 min内接种）。
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表面涂布
把0.1 ml悬液（或液体样品）和0.1 ml后续稀释液涂布于90 mm的ALOA平板；数量低时——把1 ml涂布于140 mm平板或三块90 mm平板（已干燥），仅使用初始悬液时须做双份。用涂布棒迅速涂开（每个稀释度换新的，或同一支从最高稀释度开始），静置约15 min使其吸收。
-
培养
把平板倒置于37 °C培养24 h ± 2 h，判定后再培养24 h ± 2 h。
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计数
在24 h后（晕圈尚未重叠时）和48 h后，在特征菌落 < 150个（90 mm）或 < 360个（140 mm）的平板上计数带混浊晕圈的蓝绿色菌落（推定L. monocytogenes）以及带或不带晕圈的蓝绿色菌落（推定Listeria spp.）；混合培养或晕圈大时——< 100个／< 240个。接种1 ml的三块90 mm平板按一块计。
-
确证
从每块平板（稀释度）取5个代表各种类型的菌落（不足5个时——全部），转接到非选择性培养基（L. monocytogenes：血琼脂、营养琼脂或TSYEA；Listeria spp.：TSYEA）并在37 °C下培养18–24 h。做必做试验：β-溶血、L-鼠李糖、D-木糖（带对照），可选过氧化氢酶、25 °C下动力、CAMP和显微镜下形态；菌落典型但无溶血时——做附加试验（革兰氏染色、过氧化氢酶、动力、CAMP、PCR）。
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计算与报告
由经确证的菌落数计算每g、每ml、每cm²或每件采样器具的L. monocytogenes和／或Listeria spp.数；与100 CFU/g判据（第2073/2005号条例）比较并说明偏离情况。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱37 °C ± 1 °C和25 °C ± 1 °C（可选） | 25 °C下的动力 | — |
| 干燥箱或25–50 °C培养箱 | 干燥大平板的表面 | — |
| 水浴47–50 °C | 培养基 | — |
| 90 mm和／或140 mm培养皿、无菌玻璃或塑料涂布棒 | 表面涂布 | — |
| 约3 mm或10 µl接种环、接种针、1 ml和10 ml移液管 | — | |
| 显微镜（最好带相差）、pH计（0.01；± 0.1）、冰箱5 °C ± 3 °C | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂（ALOA）——含β-葡萄糖苷酶底物和磷脂酰肌醇（晕圈来自磷脂酶C）的显色培养基，选择性因子 | — | 特征菌落的接种和计数（组成——标准的附录B） |
| 缓冲蛋白胨水／ISO 6887的稀释液；半Fraser肉汤（ISO 11290-1） | — | 初始悬液和稀释液 |
| 血琼脂、营养琼脂、TSYEA | — | 供确证的纯培养物；溶血 |
| 过氧化氢溶液（B.3）、含鼠李糖和木糖的培养基、CAMP菌株（S. aureus、Rhodococcus equi）、阳性和阴性对照菌株 | — | 确证试验 |
职业健康与安全
- L. monocytogenes——只可在生物安全2级的实验室中、在微生物学专业人员监督下操作，并仔细处置培养过的材料
- 孕妇以及患有损害细胞免疫疾病的人员不应接触Listeria培养物（对胎儿有风险）
- 用S. aureus和R. equi的CAMP试验以及血琼脂——按感染性材料处理
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 11290-2:2017-07 (ISO 11290-2:2017) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 2: Enumeration method》。
该方法的原理是什么？
计数需要连续五个阶段（流程图见附录A）：在适合样品的稀释液中制备初始悬液；把规定量的液体样品或初始悬液以及必要时的十倍稀释液表面涂布于Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂；在37 °C下培养并在24 h以及再过24 h后判定；用形态学和生化试验确证推定菌落；计算每g、每ml、每cm²或每件采样器具的菌数。初始悬液的稀释液用缓冲蛋白胨水或ISO 6887中的其他稀释液；当对同一样品同时按ISO 11290-1作检出时，可使用半Fraser肉汤（选择性因子最好在用于计数的接种之后加入；使用加有添加剂的半Fraser时应在45 min内接种平板）。
测量范围和准确度是多少？
培养基：Ottaviani和Agosti氏Listeria琼脂（ALOA）；组成和制法——附录B；要求按ISO 11133；培养：37 °C ± 1 °C；24 h ± 2 h并再加24 h ± 2 h，平板倒置；接种物：90 mm平板0.1 ml；数量低时140 mm平板或3 × 90 mm平板1 ml（须做双份）；计数：特征菌落 < 150个（90 mm）／< 360个（140 mm）；混合培养：< 100个／< 240个。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱37 °C ± 1 °C和25 °C ± 1 °C（可选）、干燥箱或25–50 °C培养箱、水浴47–50 °C、90 mm和／或140 mm培养皿、无菌玻璃或塑料涂布棒、约3 mm或10 µl接种环、接种针、1 ml和10 ml移液管、显微镜（最好带相差）、pH计（0.01；± 0.1）、冰箱5 °C ± 3 °C。
该检测用于哪些场景？
即食食品中L. monocytogenes 100 CFU/g的安全判据——第2073/2005号条例（欧共体）的参比方法（第1.2和1.3类）；干酪和乳制品、即食的腌制肉和肉制品、熏鱼、色拉、保质期长的冷藏产品；生产即食食品企业中的环境样品（表面、设备）——把Listeria spp.作为指标进行监测；饲料和原料；需要Listeria数量的货架期试验（挑战试验）；由半Fraser肉汤中的同一份悬液同时作检出（ISO 11290-1）和计数的联合检验。
需要采取哪些安全防护措施？
L. monocytogenes——只可在生物安全2级的实验室中、在微生物学专业人员监督下操作，并仔细处置培养过的材料；孕妇以及患有损害细胞免疫疾病的人员不应接触Listeria培养物（对胎儿有风险）；用S. aureus和R. equi的CAMP试验以及血琼脂——按感染性材料处理。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 11290-2。