🔴 单核细胞增生李斯特氏菌检出

微生物 PN-EN ISO 11290-1

用两阶段选择性增菌和显色平板划线法检出食品中的单核细胞增生李斯特氏菌。食品安全的关键检验。

概述

单核细胞增生李斯特氏菌是革兰氏阳性杆菌，也是最危险的食源性病原菌之一。它引起李斯特菌病 — 病死率达 20–30%（在食源性疾病中最高）。孕妇（流产、新生儿感染）、老年人和免疫功能低下者风险尤高。

该菌之所以格外危险，是因为它：能在冷藏温度（2–4°C）下繁殖、耐受高盐（可达 10% NaCl）、并能在很宽的 pH 范围（4,4–9,6）内存活。它会在食品生产车间表面形成生物膜，使清除十分困难。

PN-EN ISO 11290-1 标准是检出各类食品和饲料中该菌的基准方法。（EC）2073/2005 号法规要求 — 安全标准：供婴幼儿和医疗用途的即食食品 25 g 中不得检出；即食食品在其货架期内 ≤100 CFU/g。

方法原理

两阶段选择性增菌法：

1. **一次增菌（半量 Fraser）** — 25 g 样品 + 225 mL 半量 Fraser 肉汤（吖啶黄和萘啶酸减半）。30°C 培养 24–26 h。温和选择，使受损细胞得以恢复。 2. **二次增菌（全量 Fraser）** — 0,1 mL → 10 mL 全量 Fraser 肉汤（抑制剂足量）。37°C 培养 24–48 h。肉汤变黑（水解七叶苷 → 黑色沉淀）提示存在李斯特氏菌。 3. **选择性培养基划线** — ALOA（显色）和 Oxford/PALCAM。单增李斯特氏菌在 ALOA 上的菌落：蓝绿色并带不透明晕圈（磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C，PI-PLC）。 4. **确证** — 血琼脂溶血、CAMP 试验、25°C 动力（伞状生长）、糖发酵（鼠李糖 +、木糖 –）。

应用领域

• 即食食品 — 软质奶酪、熟肉制品、烟熏鱼
• 婴幼儿食品和特殊医学用途食品
• 肉类及肉制品（禽肉、猪肉）
• 鱼制品 — 生鲜和烟熏（三文鱼、鲭鱼）
• 乳制品 — 奶酪、冰淇淋、巴氏杀菌乳
• 即食果蔬（沙拉、果昔）
• 车间环境监测（表面、地漏和冷库涂抹样）

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 11290-1:2017

标准名称（波兰语）

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania

标准名称（英语）

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method

分步操作程序

1. 样品制备

   称取 25 g 样品于均质袋中。加入 225 mL 半量 Fraser 肉汤。均质 1–2 min。

   ⏱ 时间: 5 min

2. 一次增菌 — 半量 Fraser

   将装有样品的袋在 30±1°C 培养 24–26 小时。培养后观察肉汤 — 变黑提示七叶苷水解（存在李斯特氏菌属）。

   ⏱ 时间: 24–26 h • 🌡 温度: 30°C

3. 二次增菌 — 全量 Fraser

   取 0,1 mL 半量 Fraser 增菌液转入 10 mL 全量 Fraser 肉汤。在 37±1°C 培养 24 小时（第一次观察）至 48 小时（第二次观察）。

   ⏱ 时间: 24–48 h • 🌡 温度: 37°C

4. 由半量 Fraser 划线（24 h）

   从半量 Fraser 增菌液用接种环划线接种 ALOA 琼脂和第二种培养基（Oxford 或 PALCAM）。37°C 培养 24–48 h。

   🌡 温度: 37°C

5. 由 Fraser 划线（24 h 和 48 h）

   Fraser 肉汤培养 24 h 和 48 h 后，各用接种环划线接种 ALOA 琼脂和第二种培养基。37°C 培养 24–48 h。

   🌡 温度: 37°C

6. 平板读取

   ALOA 上：单增李斯特氏菌菌落 = 蓝绿色带不透明晕圈（PI-PLC+）。Oxford 上：黑色菌落带黑色晕圈（七叶苷 +）。

7. 分离纯培养物

   挑取至少 5 个可疑菌落。传代至 TSYEA 琼脂。37°C 培养 18–24 h。观察菌落：单增李斯特氏菌 — 细小、灰白、在 Henry 斜射光下有蓝灰色光泽。

   ⏱ 时间: 24 h • 🌡 温度: 37°C

8. 溶血试验

   由纯培养物划线接种 5% 羊血琼脂。37°C 培养 24 h。单增李斯特氏菌：窄带 β-溶血（菌落周围透明圈）。

9. CAMP 试验

   在血琼脂上竖直划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌。将待测分离株垂直划线。37°C 培养 18–24 h。单增李斯特氏菌：靠近金黄色葡萄球菌处溶血增强，靠近马红球菌处无增强。

   🌡 温度: 37°C

10. 动力试验

    穿刺接种半固体培养基（0,4% 动力琼脂）。25°C 培养 48 h。单增李斯特氏菌：在表面下 2–5 mm 处呈"伞状"生长（25°C 有动力，37°C 无动力）。

    🌡 温度: 25°C

11. 糖发酵

    鼠李糖：阳性（单增李斯特氏菌）。木糖：阴性。甘露醇：阴性。这 3 项试验可将单增李斯特氏菌与其他李斯特氏菌种区分开。

12. 判读与报告

    确证 = β-溶血 + 金黄色葡萄球菌侧 CAMP 阳性 + 伞状动力 + 鼠李糖阳性、木糖阴性 → "25 g 中检出单核细胞增生李斯特氏菌"。反之为"未检出"。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 单核细胞增生李斯特氏菌 — BSL-2 病原菌！只能在生物安全柜中操作
• 对孕妇尤其危险 — 孕期人员不得从事该菌相关工作
• 必须佩戴丁腈手套、实验服和护目镜
• 所有废物须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
• 作业后对工位消毒：70% 乙醇 + 0,5% 次氯酸钠溶液
• 羊血 — 潜在致敏源，须小心操作

常见问题