🦠 用显微镜法（参比方法）测定生乳和化学防腐乳中的体细胞数——将0,01 ml样品涂布于载玻片1 cm²区域、干燥、用Newman-Lampert染液（≥ 15 min）或溴化乙锭（荧光显微镜）染色，计数规定面积内的有核细胞并用工作因子换算为每毫升细胞数，PN-EN ISO 13366-1

微生物学 PN-EN ISO 13366-1

概述

本标准内容。PKN目录卡片PN-EN ISO 13366-1:2009（波兰文版）的范围，全文（我们的翻译）：“描述了生乳和化学防腐乳中体细胞的计数方法。该方法用于制备标准试样和测定参比方法值，这些数值是校准机械和自动测定体细胞数的方法所必需的。方法包括：定义、方法原理、试剂说明、仪器、试样制备、测定以及结果的计算和表示方式”。我们阅读的标准文本是ISO 13366-1:2008 | IDF 148-1:2008预览，从封面到8.1.1末尾（第5页）；我们没有8.1.2（溴化乙锭染色）、8.2（计数）、第9–11章（计算、精密度、试验报告）以及附录A–C。

依据ISO 13366-1:2008文本（前言、第1–8.1.1条）。本标准由ISO/TC 34/SC 5（乳和乳制品）与国际乳品联合会（IDF）共同制定。第二版是ISO 13366-1:1997的技术修订版，同时取代IDF 148A:1995；该系列第2部分是荧光光电计数仪的使用指南。范围：用于生乳和化学防腐乳的显微镜（参比）方法；在满足所述前提条件下适用于牛乳；适用于制备校准机械化和自动化方法所需的标准样品和参比值。定义（2.1）：体细胞是有细胞核的细胞，即按本标准测定的所有白细胞和上皮细胞。原理（3）：将一份乳样在载玻片上涂成涂片，干燥，细胞染色后在显微镜下计数；规定面积内的细胞数乘以工作因子得到每毫升细胞数。染料（4.1，附警告：四氯乙烷有毒，溴化乙锭致突变——配制和染色在通风橱内进行）：改良Newman-Lampert染液（Levowitz-Weber改良）——95 %乙醇54,0 ml、四氯乙烷40,0 ml（可用同体积二甲苯替代）、亚甲蓝0,6 g、冰乙酸6,0 ml；混合物在65 °C水浴中加热，冷却至4 °C，加酸，过滤，使用前再次过滤。溴化乙锭：储备液0,25 g溶于100 ml水（在2 °C ± 2 °C避光保存最多两个月），缓冲液为邻苯二甲酸氢钾0,51 g和氢氧化钾0,162 g溶于100 ml，工作液为2 ml储备液+8 ml缓冲液+0,1 ml Triton X-100+90 ml水，使用前立即配制。磷酸盐缓冲液PBS（4.2）：NaCl 8 g、KCl 0,2 g、Na₂HPO₄·7H₂O 1,15 g、KH₂PO₄ 0,2 g配成1000 ml，pH 7,2 ± 0,1（可使用市售产品）。仪器（5）：40、50和65 °C（± 2 °C）水浴；10–12 µm过滤器；放大500–1000倍的显微镜（使用溴化乙锭时须配荧光装置）；0,01 ml微量注射器，公差不大于2 %；带证书的测微计；带1 cm² ± 5 %（95–105 mm²）矩形或圆形区域的载玻片，或20 mm × 5 mm或直径11,28 mm的模板；区域上下内宽之间、左右内高之间（圆形区域为竖直与水平内径之间）的差不宜超过0,2 mm。取样（6）不属于本方法——推荐ISO 707 | IDF 50。保存（7.1）：4 °C ± 2 °C，取样后6 h内检测；较长时间保存需加防腐剂——硼酸不超过0,6 g、溴硝丙二醇不超过0,05 g、重铬酸钾不超过0,1 g/100 ml样品——并在4 °C ± 2 °C保存不超过6天。制备（7.2）：在40 °C水浴中加热、混匀，冷却至微量注射器的校准温度（如20 °C）；超过1 000 000个细胞/ml的样品用缓冲液稀释至约500 000个细胞/ml（ISO 13366-1:2008文本中该因子写作d = Vs/(Vs × Vb)——分母为乘号，而稀释因子按理应为Vs + Vb之和；勘误AC:2009是否对此作了修改，我们未核实；记录d、Vs和Vb）。测定（8）：每个样品至少两张涂片，计数较好的一张；载玻片浸入95 %乙醇、火焰灼烧并冷却；按8.1.1或8.1.2染色（山羊乳见附录B）。按8.1.1：用微量注射器取0,01 ml样品于1 cm²区域，用针头均匀涂布于整个区域（包括边缘），室温干燥，浸入Newman-Lampert染液至少15 min，干燥，用自来水轻轻冲洗，再干燥并防尘保存。

状态（PKN目录卡片截至02.10.2026）。PN-EN ISO 13366-1:2009卡片（波兰文版，发布于17-02-2009，21页，价格组L）无“已撤销”标记：食品、农业和林业部门，KT 35乳和乳制品技术委员会，ICS 67.100.10，“引入：EN ISO 13366-1:2008 [IDT]，ISO 13366-1:2008 [IDT]”，“取代：PN-EN ISO 13366-1:2008——英文版”，附加文件：PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009和PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009。英文版PN-EN ISO 13366-1:2008卡片标有“已撤销”（撤销日期17-02-2009，被2009年波兰文版取代）。PKN检索“PN-EN ISO 13366-1”（02.10.2026）还显示PN-EN ISO 13366-1:2000（波兰文版）。

多少实验室、以何种形式（认可范围数据库副本，数据截至17.09.2026，读取于02.10.2026）。编号13366-1出现在7家实验室的7条记录中：AB 485、AB 545、AB 546、AB 585、AB 604、AB 620、AB 685。在PCA网站的现行范围中（读取于02.10.2026，版本日期14.10.2025至19.08.2026），所有实验室都给出2009版及其更正：AC:2009和Ap1:2009（AB 545、AB 546、AB 585、AB 604、AB 620、AB 685——顺序不一，AB 685分三行列出）或仅AC:2009（AB 485）。“实验室”标签检索以“PN-EN ISO 13366-1”开头的记录，显示全部7家实验室——已于02.10.2026在生产服务器labcoda.pl上用该标签查询核实。

实验室检测什么（PCA条目）。均为“生乳”（AB 604为“生牛乳”，AB 485为“乳”）——“体细胞数，显微镜法”。两家实验室给出范围：AB 485为100 000至2 000 000个细胞/ml，AB 685为10 000个细胞/ml起；其余五家未给范围。AB 485还按第2部分测定同一特性（PN-EN ISO 13366-2:2007，荧光光电法，1000至1 000 000个细胞/ml）——显微镜法正是其参比。

容易得到看似正确结果的地方。取样和保存：无防腐剂样品须在6 h内检测，防腐样品在4 °C ± 2 °C下最多6天；标准给出防腐剂上限（硼酸0,6 g、溴硝丙二醇0,05 g、重铬酸钾0,1 g/100 ml）和保存时间上限——超出这些限值的样品所得结果不满足方法条件，尽管其本身看起来并无异常。测量：0,01 ml体积由公差2 %的微量注射器分配，标准要求将样品冷却至微量注射器的校准温度（7.2）——省略这一步会改变分配的体积，而换算为每毫升正取决于该体积；载玻片区域为1 cm² ± 5 %，其相对尺寸（宽、高或直径）之差不宜超过0,2 mm——区域不同的载玻片需要重新计算工作因子；乳样还须涂布到区域边缘。计算：超过1 000 000个细胞/ml的样品用缓冲液稀释至约500 000个细胞/ml并记录d、Vs和Vb，d的公式须对照含勘误AC:2009的版本核实（ISO 13366-1:2008文本分母为Vs × Vb）——稀释须在按第9章计算时考虑，而该章我们没有。方法的作用：它是自动计数仪的参比方法（另有PN-EN ISO 13366-2条目）——显微镜值用于校准计数仪，而非相反。范围：AB 685给出的范围从10 000个细胞/ml起，AB 485从100 000个细胞/ml起；在我们阅读的部分中标准本身未给出定量限。

我们不提供的内容。我们没有8.1.2和8.2以及第9–11章：溴化乙锭逐步染色方法、需计数的视野或条带数、工作因子公式（矩形——连续视野或条带，圆形——连续视野）、重复性和再现性限以及试验报告内容；也没有附录A（协同试验）、B（山羊乳染色）和C（泊松分布）。因此我们不提供任何精密度数值和最少计数细胞数。

方法原理

将0,01 ml乳样（细胞数超过1 000 000/ml时用缓冲液稀释）涂布于载玻片1 cm²区域，干燥并染色（Newman-Lampert或溴化乙锭）；在显微镜下计数规定面积内的有核细胞并乘以工作因子，得到每毫升细胞数。

应用领域

• 生乳——用显微镜法测定体细胞数；PCA范围中有7家实验室
• 用于校准自动计数仪的参比值和标准样品（PN-EN ISO 13366-2）
• 化学防腐乳（硼酸、溴硝丙二醇、重铬酸钾），保存不超过6天

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 13366-1:2009 (wersja polska; EN ISO 13366-1:2008 IDT, ISO 13366-1:2008 IDT) z PN-EN ISO 13366-1:2009/AC:2009 i PN-EN ISO 13366-1:2009/Ap1:2009

标准名称（波兰语）

Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 1: Metoda mikroskopowa (Metoda odniesienia)

标准名称（英语）

Milk — Enumeration of somatic cells — Part 1: Microscopic method (Reference method)

分步操作程序

1. 样品

   在4 °C ± 2 °C保存；6 h内检测，或加防腐剂后最多6天内检测。PN-EN ISO 13366-1:2009现行有效（PKN卡片截至02.10.2026）。

2. 制备

   在40 °C水浴中加热、混匀，冷却至微量注射器校准温度；> 1 000 000个细胞/ml的样品用缓冲液稀释至约500 000/ml，记录d、Vs、Vb。

3. 涂片

   至少两张涂片：0,01 ml涂于已脱脂（95 %乙醇、火焰灼烧）载玻片的1 cm²区域，均匀覆盖整个区域包括边缘；室温干燥。

4. 染色

   Newman-Lampert染液至少15 min，干燥，自来水冲洗，干燥（8.1.1）；或按8.1.2用溴化乙锭（该条我们没有）。

5. 计数和结果

   在显微镜下计数较好涂片中的细胞，并按第9章用工作因子换算为细胞/ml（公式我们没有）。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 四氯乙烷有毒，溴化乙锭致突变——在通风橱内配制溶液和染色，佩戴防护装备；溢洒物须去活化处理（4.1）
• 建议仅对需要长期保存的样品使用重铬酸钾作防腐剂（7.1）
• 技术说明：这是校准自动计数仪的参比方法；无防腐剂样品——6 h内检测，有防腐剂——在4 °C ± 2 °C下最多6天

常见问题