🔴 水中军团菌
以 BCYE/GVPC 培养基培养法结合热处理或酸处理，检出并定量测定水中军团菌。卫生监督部门唯一认可的方法。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 11731:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 12
- 各步骤合计时间: 9 天 2 小时 25 分钟–12 天 2 小时 25 分钟
- 结果: cfu/100 mL（菌落形成单位）
- 限值: ≤100 cfu/100 mL（无需处置），>1000 —— 警报
- 培养温度: 36 ± 1 °C
概述
军团菌属（Legionella）是革兰氏阴性杆菌，其中对人危害最大的是嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）—— 军团病（退伍军人症）的病原体，为重症肺炎，病死率 5–30%。军团菌天然存在于水环境中，但当其在人工水系统（热水系统、冷却塔、喷泉、按摩浴缸、加湿器与空调）中大量繁殖时即构成健康风险。
感染经吸入途径发生 —— 吸入含菌的水气溶胶。军团菌不会人传人。最适繁殖温度为 25–45 °C，最旺盛在 35–37 °C；低于 20 °C 不生长，高于 60 °C 死亡。
按 PN-EN ISO 11731:2017 的培养法是波兰国家卫生监督机构唯一认可的方法。方法包括膜过滤或直接涂布、样品预处理（50 °C/30 分钟热处理或 pH 2,2/5 分钟酸处理）以清除伴随菌群，随后在 GVPC（选择性）与 BCYE（非选择性）培养基上于 36±1 °C 潮湿气氛中培养 7–10 天。
按卫生部关于内部供水系统水质的条例，本项目为必检（≤100 cfu/100 mL —— 无需处置；>100 —— 清洗与消毒；>1000 —— 立即采取纠正措施）。出结果需等待 9–15 天，这是培养法的主要缺点。
方法原理
水样经膜过滤（0,2 µm）或离心浓缩。浓缩液进行清除伴随菌群的处理：热处理（50±1 °C/30 分钟）或酸处理（HCl/KCl 缓冲液 pH 2,2，作用 5 分钟）。样品接种于 GVPC 培养基（BCYE 琼脂加甘氨酸、多粘菌素 B、万古霉素、放线菌酮等添加剂，用以抑制细菌与真菌）以及不含添加剂的 BCYE 培养基（对照）。在 36±1 °C、湿度 >80% RH 条件下培养 7–10 天。军团菌菌落呈灰白色、玻璃样，具「碎玻璃」样结构。确认：在不含 L-半胱氨酸的 BCYE 上不生长（军团菌生长需 L-半胱氨酸）。
应用领域
- 热水系统监测（医院、酒店、多户住宅）
- 冷却塔与空调系统控制
- 泳池、按摩浴缸、水疗与喷泉用水检测
- 流行病学调查 —— 军团病暴发
- 热消毒（>70 °C）与化学消毒效能控制
- 医疗机构用水监测（强制）
- 受物业管理方委托的水质检测
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | cfu/100 mL（菌落形成单位） |
| 限值 | ≤100 cfu/100 mL（无需处置），>1000 —— 警报 |
| 培养温度 | 36 ± 1 °C |
| 培养时间 | 7–10 天（第 3、5、7、10 天判读） |
| 气氛 | 有氧，湿度 >80% RH |
| 出结果时间 | 9–15 天（含预处理与确认） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 11731:2017
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Legionella
- 标准名称（英语）
- Water quality — Enumeration of Legionella
分步操作程序
-
采样
采集至少 1 L 水。采样前不得放水冲洗管路。含氯时加入硫代硫酸钠。5–20 °C 运输，24 小时内分析。
-
膜过滤浓缩
将 1 L 样品经 0,2 µm（聚碳酸酯）滤膜过滤，无菌剪下滤膜置于装有 10 mL 留样水的无菌容器中，剧烈涡旋 2 分钟。
-
热处理
将浓缩液分为 2 份，其中一份在 50±1 °C 水浴中加热 30 分钟（清除不耐热菌群），另一份不处理。
-
酸处理（替代方案）
也可不做热处理：按 1:1 加入 HCl/KCl 缓冲液（pH 2,2），作用 5 分钟后用 KOH 缓冲液中和。
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接种培养基
将 0,1 mL 样品（处理与未处理的）分别涂布于 GVPC 与 BCYE 平板，用玻璃刮铲涂匀，每份做平行两份。
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培养
在 36±1 °C、湿度 >80% RH 条件下培养。可用密封袋或带水盘的培养箱。平板不得倒置。
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判读 —— 第 3 与第 5 天
用体视显微镜检查平板。若 GVPC 平板被伴随菌群过度生长，应换用另一种预处理方式重新接种。
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判读 —— 第 7 与第 10 天
计数具典型形态的菌落：灰白色、玻璃样、有光泽、呈「碎玻璃」结构，直径 1–3 mm，并标记可疑菌落。
-
确认 —— 传代
将可疑菌落分别接种至含 L-半胱氨酸与不含 L-半胱氨酸的 BCYE，36 °C 培养 48 小时。含半胱氨酸生长、不含则不生长 = 军团菌属。
-
血清群鉴定
对确认的军团菌菌落做乳胶凝集试验，鉴定嗜肺军团菌 sg 1（最常见致病型）与 sg 2–14。
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结果计算
结果 =（确认菌落数 × 稀释倍数）/ 取样体积，以 cfu/100 mL 或 cfu/L 报告。
-
质量控制
阳性对照：L. pneumophila ATCC 33152；阴性对照：无菌水；并检查培养箱湿度与培养基无菌性。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 膜过滤装置（0,2 µm） | Sartorius Combisart、Merck EZ-Fit，配 0,2 µm 滤膜 | 3 000–12 000 PLN |
| 带湿度控制的培养箱 | Binder KBF 115、Memmert HPP110（配水盘） | 8 000–25 000 PLN |
| 恒温水浴 | Memmert WNB 14、Julabo CORIO C-B5（热处理用 50 °C） | 5 000–15 000 PLN |
| 实验室涡旋振荡器 | IKA Vortex 3、Scientific Industries Vortex-Genie 2 | 1 500–4 000 PLN |
| 高压灭菌器 | Tuttnauer ELV 2540 | 20 000–45 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Esco Airstream Class II、Telstar Bio II Advance | 20 000–50 000 PLN |
| 体视显微镜 | Zeiss Stemi 305、Olympus SZ61 | 5 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| BCYE 琼脂（缓冲活性炭酵母浸膏） | — | 基础培养基，含 L-半胱氨酸、焦磷酸铁、活性炭、酵母浸粉与 ACES 缓冲液。厂商：Oxoid、Merck、bioMérieux |
| GVPC 琼脂（选择性添加剂） | — | BCYE + 甘氨酸 + 多粘菌素 B + 万古霉素 + 放线菌酮，用于抑制伴随菌群 |
| 不含 L-半胱氨酸的 BCYE | — | 对照培养基 —— 军团菌无 L-半胱氨酸则不生长，用于确认 |
| 盐酸 L-半胱氨酸 | 52-89-1 | BCYE 生长添加剂，浓度 0,4 g/L。军团菌必需 |
| HCl/KCl 酸缓冲液 pH 2,2 | — | 用于样品酸处理 —— 清除伴随菌群，作用 5 分钟 |
| 0,2 µm 聚碳酸酯滤膜 | — | 聚碳酸酯（PC），47 mm，黑色或白色，用于军团菌样品过滤 |
| 乳胶试剂盒 | — | 乳胶凝集试验，用于鉴定嗜肺军团菌血清群（sg 1–14）。Oxoid DR0800 |
职业健康与安全
- 嗜肺军团菌 —— BSL-2 病原体！全部操作须在 II 级生物安全柜中进行，接触气溶胶时佩戴 FFP2/FFP3 口罩
- 不得涡旋敞口的样品管 —— 有产生感染性气溶胶的风险
- pH 2,2 酸缓冲液 —— 腐蚀性，佩戴手套与护目镜
- 放线菌酮（GVPC 中）—— 有毒、致突变，避免接触，在通风柜中操作
- 感染性材料 —— 121 °C/30 分钟高压灭菌，平板须装入可高压灭菌的袋中
- 温度 >40 °C 的系统水样 —— 采样时有烫伤风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 11731:2017 — 《Water quality — Enumeration of Legionella》。
该方法的原理是什么？
水样经膜过滤（0,2 µm）或离心浓缩。浓缩液进行清除伴随菌群的处理：热处理（50±1 °C/30 分钟）或酸处理（HCl/KCl 缓冲液 pH 2,2，作用 5 分钟）。
测量范围和准确度是多少？
结果：cfu/100 mL（菌落形成单位）；限值：≤100 cfu/100 mL（无需处置），>1000 —— 警报；培养温度：36 ± 1 °C；培养时间：7–10 天（第 3、5、7、10 天判读）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 9 天 2 小时 25 分钟–12 天 2 小时 25 分钟。整个程序共 12 个步骤。
需要哪些设备？
膜过滤装置（0,2 µm）、带湿度控制的培养箱、恒温水浴、实验室涡旋振荡器、高压灭菌器、II 级生物安全柜、体视显微镜。核心仪器的参考价格（膜过滤装置（0,2 µm））：3 000–12 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
热水系统监测（医院、酒店、多户住宅）；冷却塔与空调系统控制；泳池、按摩浴缸、水疗与喷泉用水检测；流行病学调查 —— 军团病暴发；热消毒（>70 °C）与化学消毒效能控制；医疗机构用水监测（强制）；受物业管理方委托的水质检测。
需要采取哪些安全防护措施？
嗜肺军团菌 —— BSL-2 病原体！全部操作须在 II 级生物安全柜中进行，接触气溶胶时佩戴 FFP2/FFP3 口罩；不得涡旋敞口的样品管 —— 有产生感染性气溶胶的风险；pH 2,2 酸缓冲液 —— 腐蚀性，佩戴手套与护目镜；放线菌酮（GVPC 中）—— 有毒、致突变，避免接触，在通风柜中操作；感染性材料 —— 121 °C/30 分钟高压灭菌，平板须装入可高压灭菌的袋中；温度 >40 °C 的系统水样 —— 采样时有烫伤风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 11731。