🦠 生鲜乳中的体细胞——荧光光电计数仪（转盘式细胞术或流式细胞术）
三句话速览
把乳样在仪器中与缓冲液和结合细胞核DNA的荧光染料混合；每一个经过荧光显微镜物镜（在旋转圆盘上或在流动池中）的着色颗粒产生一个电脉冲，脉冲高度的分布把细胞与噪声区分开；结果以细胞数/ml表示，并对照ISO 13366-1显微镜法校准——按第853/2004号条例（欧共体），生鲜乳的标准为 ≤ 400 000个/ml。该检测依据 PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006)；结果：体细胞数/ml；= 计数值 × 工作系数。整个程序共 6 个步骤；主要用于：乳品评价实验室（收购）对生鲜乳的常规评价——按第853/2004号条例（欧共体）标准为 ≤ 400 000个细胞/ml、奶牛生产性能的评定——单个动物的样品（乳房状态、乳腺炎的诊断）、满足标准前提条件后的山羊乳、绵羊乳和水牛乳。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 结果: 体细胞数/ml；= 计数值 × 工作系数
- 法定标准（853/2004）: 生鲜牛乳 ≤ 400 000个/ml（滚动几何平均值）
- 保存: 0–6 °C，不得冷冻，96 h内计数；冷冻使结果降低10–20 %
概述
ISO 13366-2 | IDF 148-2:2006给出了用荧光光电计数仪对生鲜乳和化学防腐乳中的体细胞计数时工作条件的指南，其计数部分采用旋转圆盘技术或流式细胞术；它涉及牛乳，在满足规定的前提条件时也涉及山羊乳、绵羊乳和水牛乳。该版本取代了ISO 13366-2:1997和ISO 13366-3:1997以及IDF 148A:1995（方法B和C）。体细胞定义为由于细胞核中DNA着色而呈现出高于阈值荧光的细胞；其数量以每ml的细胞数表示。基准方法为ISO 13366-1 | IDF 148-1显微镜法；校准和质量控制依据ISO 8196-1/-2（间接方法的准确度）、标准物质（ISO Guide 34）和能力验证（ISO Guide 43-1）。第853/2004号条例（欧共体）（附件III第IX节）为生鲜牛乳规定了体细胞数 ≤ 400 000个/ml的标准（滚动几何平均值），与30 °C下细菌数 ≤ 100 000个/ml并列，并允许经主管部门同意对某些干酪作出例外。Fossomatic（FOSS）等仪器声明符合ISO 13366-2 / IDF 148-2:2006，并具有生鲜牛乳体细胞计数的MicroVal认证。
方法原理
荧光光电计数仪具有吸取试剂和样品的功能、混合部分和计数部分。在混合部分，严格受控体积的样品与缓冲液和染料溶液被定量加入并混合（在小杯、腔室、离心机、样品环或通往流动池的管路中）；混合液的一部分进入计数部分的物面。每一个在荧光显微镜下观察到的着色颗粒产生一个电脉冲，该脉冲经滤波、放大并被记录；脉冲高度的分布经电子处理，把噪声与归属于细胞的脉冲区分开——甄别阈值可以是固定的或动态的。在转盘式细胞术中，混合液的薄膜由喷嘴涂布在竖直旋转圆盘的顶部，圆盘构成移动的物面；在流式细胞术中，混合液的一部分被引入毛细流动池中高速的鞘液流，加速后形成一条细丝，其中的细胞经动态聚焦后从物镜前通过。双通道仪器按两台独立设备对待。结果 = 计数值 × 工作系数（系数越低越有利于精密度）；缓冲液／染料与样品的体积比很重要。影响结果的因素：样品瓶（密闭、适当的空余体积——过大易于乳脂结块，过小则妨碍混合）、采样（混合乳须充分混匀——细胞聚集在上层和下层；对单个动物的样品须取整次挤奶的代表性样品）、0–6 °C冷藏且不冷冻、96 h内计数（冷冻和解冻使结果降低10–20 %）、24 h内防腐（硼酸 ≤ 0.6 g/100 ml——在6–12 °C下24 h；叠氮化钠 ≤ 0.024 g/100 ml——在2–10 °C下72 h；溴硝丙二醇 ≤ 0.05 g/100 ml——在2–12 °C下6天；重铬酸钾 ≤ 0.2 g/100 ml——在2–12 °C下6天；色标：专利蓝V ≤ 0.15 mg/100 ml、黄橙S ≤ 1 mg/100 ml、专利蓝V + 曙红B混合物）、干扰物质（超过限值的防腐剂和色标、亚甲蓝 > 0.06 mg/100 ml）、细胞裂解（脉冲分布左移——结果偏低）、有问题的样品（带凝块的急性乳腺炎乳、受污染的乳、红细胞数量多的乳、初乳、泌乳末期的乳、酸败乳）、仪器状态（搅拌器、管路的通畅、光源和光电倍增管；转盘式中——液膜的位置、物面和清洁海绵的洁净；流式中——样品细丝的形态和鞘液的流动）。试剂须为分析纯和细菌学级，去离子水 < 10 µS/cm。
应用领域
- 乳品评价实验室（收购）对生鲜乳的常规评价——按第853/2004号条例（欧共体）标准为 ≤ 400 000个细胞/ml
- 奶牛生产性能的评定——单个动物的样品（乳房状态、乳腺炎的诊断）
- 满足标准前提条件后的山羊乳、绵羊乳和水牛乳
- 乳品厂实验室——原料验收时的控制；与成分分析仪（CombiFoss）联用并考虑防腐剂的影响
- 能力验证以及对照ISO 13366-1显微镜法的校准
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | 体细胞数/ml；= 计数值 × 工作系数 |
| 法定标准（853/2004） | 生鲜牛乳 ≤ 400 000个/ml（滚动几何平均值） |
| 保存 | 0–6 °C，不得冷冻，96 h内计数；冷冻使结果降低10–20 % |
| 防腐剂（最大值、时间） | 硼酸0.6 g/100 ml（24 h，6–12 °C）；叠氮化钠0.024 g/100 ml（72 h，2–10 °C）；溴硝丙二醇0.05 g/100 ml（6天，2–12 °C）；重铬酸钾0.2 g/100 ml（6天，2–12 °C） |
| 色标 | 专利蓝V ≤ 0.15 mg/100 ml；黄橙S（E110） ≤ 1 mg/100 ml；专利蓝V + 曙红B ≤ 0.03 + 0.45 mg/100 ml |
| 干扰 | 亚甲蓝 > 0.06 mg/100 ml；超过限值的防腐剂；细胞裂解；凝块、红细胞、初乳、酸败乳 |
| 水 | 去矿物质水，电导率 < 10 µS/cm |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006)
- 标准名称（波兰语）
- Mleko — Oznaczanie liczby komórek somatycznych — Część 2: Przewodnik obsługi liczników fluoro-opto-elektronicznych
- 标准名称（英语）
- Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters
分步操作程序
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采样
使用洁净、干燥、密闭且空余体积适当的样品瓶；混合乳须充分混匀（细胞聚集在上层和下层）；对单个动物应取整次挤奶的代表性样品（诊断时——取自部分乳区）。
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冷藏或防腐
把样品立即冷却至0–6 °C，不得冷冻；96 h内计数。如需防腐——在24 h内按允许浓度加入防腐剂（硼酸、叠氮化物、溴硝丙二醇或重铬酸盐），可加色标，并按规定条件保存；确认对所用仪器无干扰。
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仪器的检查
检查搅拌器、管路的通畅（凝块、污物、沉积）、光源、光电倍增管和放大倍数；转盘式计数仪中——检查液膜的位置、物面的洁净和海绵的更换、冲洗液容器的排空；流式中——检查样品细丝的形态和鞘液的流动。
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校准
按ISO 8196-1/-2，使用标准物质（无可用的CRM；IRM由白细胞悬液制备或通过乳的微滤制备，5–8个水平）对照ISO 13366-1显微镜法进行校准；双通道仪器的每个通道分别评价。
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测定
仪器定量加入样品并与缓冲液／染料混合，把混合液涂布到圆盘上或引入流动池，并计数高于阈值的脉冲；避免有问题的样品（凝块、初乳、酸败乳），在其之后检查并清洗流路。
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结果
给出每ml的体细胞数（计数值 × 工作系数）；对生鲜乳的法定评价，计算滚动几何平均值并与400 000个/ml比较；参加能力验证（ISO Guide 43-1）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 荧光光电计数仪（转盘式细胞术或流式细胞术） | 如FOSS Fossomatic——符合ISO 13366-2 / IDF 148-2:2006，具MicroVal证书 | — |
| 配光电倍增管的荧光显微镜（内置） | 光源、放大器、甄别器 | — |
| 密闭且空余体积适当的样品瓶 | 洁净干燥；自动采样器须经验证 | — |
| 冷藏箱0–6 °C | 不得冷冻 | — |
| 标准物质（IRM/SRM）和校准样品 | 牛白细胞在UHT乳中的悬液或乳的微滤（HCM/LCM组分，5–8个水平，脂肪3.5 %） | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 缓冲液和荧光染料溶液（按仪器制造商的规定） | — | 使体细胞核的DNA着色 |
| 鞘液（流式细胞术）和冲洗液 | — | 形成样品细丝、清洗管路 |
| 防腐剂：硼酸、叠氮化钠、溴硝丙二醇、重铬酸钾；色标专利蓝V、黄橙S、曙红B | — | 对运输样品的防腐（在浓度限值内） |
| 低细胞数的UHT乳或灭菌乳、“聚丙烯2000”、溴硝丙二醇、白细胞悬液 | — | 按第6.1.2.1条制备校准样品：1 000 ml乳 + 1 ml“聚丙烯2000” + 0.4 g溴硝丙二醇，然后加入白细胞悬液，其加入量应使细胞数达到所需的范围。注意：该试剂的名称系照标准原文逐字引用——ISO 13366-2:2006第6.1.2.1条写作“1 ml of polypropylene 2000”，并且在其他任何地方都没有对该名称作出解释。该写法有时被理解为质量约2000的聚丙二醇（消泡剂），但标准并未这样说，而我们不对标准作解释——在制备校准样品之前，请与仪器供应商确定该试剂。 |
职业健康与安全
- 叠氮化钠和重铬酸钾（防腐剂）——有毒；叠氮化物在下水管道中会生成有爆炸性的金属叠氮化物；重铬酸盐——致癌
- 结合DNA的荧光染料——有致突变性，须戴手套；试剂废物按当地规定处理
- 生鲜乳可能含有致病菌（Listeria、Salmonella、葡萄球菌）——注意工作卫生
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 13366-2:2007 (ISO 13366-2:2006 | IDF 148-2:2006) — 《Milk — Enumeration of somatic cells — Part 2: Guidance on the operation of fluoro-opto-electronic counters》。
该方法的原理是什么？
荧光光电计数仪具有吸取试剂和样品的功能、混合部分和计数部分。在混合部分，严格受控体积的样品与缓冲液和染料溶液被定量加入并混合（在小杯、腔室、离心机、样品环或通往流动池的管路中）；混合液的一部分进入计数部分的物面。
测量范围和准确度是多少？
结果：体细胞数/ml；= 计数值 × 工作系数；法定标准（853/2004）：生鲜牛乳 ≤ 400 000个/ml（滚动几何平均值）；保存：0–6 °C，不得冷冻，96 h内计数；冷冻使结果降低10–20 %；防腐剂（最大值、时间）：硼酸0.6 g/100 ml（24 h，6–12 °C）；叠氮化钠0.024 g/100 ml（72 h，2–10 °C）；溴硝丙二醇0.05 g/100 ml（6天，2–12 °C）；重铬酸钾0.2 g/100 ml（6天，2–12 °C）。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
荧光光电计数仪（转盘式细胞术或流式细胞术）、配光电倍增管的荧光显微镜（内置）、密闭且空余体积适当的样品瓶、冷藏箱0–6 °C、标准物质（IRM/SRM）和校准样品。
该检测用于哪些场景？
乳品评价实验室（收购）对生鲜乳的常规评价——按第853/2004号条例（欧共体）标准为 ≤ 400 000个细胞/ml；奶牛生产性能的评定——单个动物的样品（乳房状态、乳腺炎的诊断）；满足标准前提条件后的山羊乳、绵羊乳和水牛乳；乳品厂实验室——原料验收时的控制；与成分分析仪（CombiFoss）联用并考虑防腐剂的影响；能力验证以及对照ISO 13366-1显微镜法的校准。
需要采取哪些安全防护措施？
叠氮化钠和重铬酸钾（防腐剂）——有毒；叠氮化物在下水管道中会生成有爆炸性的金属叠氮化物；重铬酸盐——致癌；结合DNA的荧光染料——有致突变性，须戴手套；试剂废物按当地规定处理；生鲜乳可能含有致病菌（Listeria、Salmonella、葡萄球菌）——注意工作卫生。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 13366-2。