🦠 水中的体细胞大肠菌噬菌体——双层琼脂噬菌斑法与大肠埃希氏菌宿主菌株
三句话速览
把水样与少量半固体培养基混合，加入大肠埃希氏菌宿主菌株的培养物，倾注在固体培养基上；在 (36 ± 2) °C 培养后，在密集的菌苔中计数可见的噬菌斑。该检测依据 PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską)；所测的量：每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数（pfp/pfu）。整个程序共 10 个步骤；主要用于：按《法律公报》2026 年第 748 项对原水的运行监测——参照值 50 pfu/100 ml、就肠道病毒的去除评价水处理效能（经各道屏障之后的对数去除值）、自来水厂取水的地表水与地下水。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 所测的量: 每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数（pfp/pfu）
- 宿主菌株——洁净水: 大肠埃希氏菌 C 菌株，ATCC 13706（饮用水、未受污染的天然水）
- 宿主菌株——受污染的水: 大肠埃希氏菌 CN 菌株，ATCC 700078（亦称 WG5）——对萘啶酸有抗性的突变株
概述
体细胞大肠菌噬菌体是感染大肠埃希氏菌选定菌株（以及相近菌株）的细菌病毒，它们以附着于细胞壁作为感染的第一步。在宿主细菌的密集菌苔中，它们形成可见的噬菌斑——透亮区。它们比指示菌更耐消毒，并能在距污染源相当远处存活，因此被视为肠道病毒存在的指示以及评价处理过程中病毒去除效能的工具。
标准描述通过把样品与适当的宿主菌株一同培养来检出并计数体细胞大肠菌噬菌体。它适用于各类水、污泥和污水污泥浸提液（必要时经稀释），也适用于软体动物浸提液。噬菌体数量少时需要样品的预富集步骤——该标准（2000 年）在适用范围中预告有一份专门文件，并在前言中列出该系列第 3 部分「Concentration methods」；卫生部长的条例准许为此使用 PN-EN ISO 10705-3。
在波兰，体细胞大肠菌噬菌体是作为运行参数进入法规的。卫生部长 2026 年 5 月 22 日的条例（《法律公报》2026 年第 748 项）准许用 PN-EN ISO 10705-2 和 PN-EN ISO 10705-3 测定它们，并在附件 7 表 2 中为原水规定 50 pfu/100 ml 的参照值：超过该值即须在后续各处理阶段之后进行分析，以确定对数去除值并判断致病病毒穿透的风险是否受控。本条目中的说明出自 ISO 10705-2:2000 的正文——那是第一版也是唯一的一版，ISO 已在 2021 年 8 月 5 日的系统复审中确认；下一次复审始于 2026 年 7 月 15 日，尚未结束。该标准的波兰采用文本（PN-EN ISO 10705-2，采用 EN ISO 10705-2）我们不加出版年份地援引：PKN 的目录卡片在本条目编写期间未能核查，因为当时 PKN 商店无法访问；在实验室的出版物中出现带 2005 年的标识。本条目内部有一处已记录但尚未了结的出入：在来源清单中有一条被描述为 PN-EN ISO 10705-2:2005 目录卡片的条目，并带有完整数据（出版于 22-12-2005，22 页，KT 120，采用 EN ISO 10705-2:2001 [IDT] 和 ISO 10705-2:2000 [IDT]，没有「撤销日期」和「被取代为」两栏）。我们不裁定这些数据是出自卡片本身还是出自别的转述——在我们亲自看到该卡片之前，标题中保留不带年份的标识，而 2005 这个年份视为未经确认。NIZP–PZH 按 PN-EN ISO 10705-2 所做的研究，在地下水源原水样品中有 8 %、在地表水源样品中有 89 % 检出体细胞大肠菌噬菌体，而在任何一个经处理水样品中都未检出。
本条目中的波兰文标题是我们的工作译名，而不是官方标题：标题未在 PKN 卡片上得到确认，因为商店无法访问；卫生部长的条例中使用的拼写是「colifagi somatyczne」[体细胞大肠菌噬菌体；条例采用 colifagi 的拼写]。
方法原理
把样品与少量半固体生长培养基混合。加入宿主菌株的培养物，并把全部混合物倾注在固体培养基上。随后进行培养并读板，计数可见的噬菌斑。结果表示为每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数——pfp，也称为噬菌斑形成单位 pfu。宿主菌株的选择取决于样品的细菌污染程度：对细菌含量低的水采用大肠埃希氏菌 C 菌株，对严重污染的水和废水采用对萘啶酸有抗性的突变株，这样可以抑制样品的细菌本底。
应用领域
- 按《法律公报》2026 年第 748 项对原水的运行监测——参照值 50 pfu/100 ml
- 就肠道病毒的去除评价水处理效能（经各道屏障之后的对数去除值）
- 自来水厂取水的地表水与地下水
- 废水和严重污染的水——使用对萘啶酸有抗性的宿主菌株
- 污泥和污水污泥浸提液（必要时经稀释）
- 软体动物浸提液——标准在适用范围中明确列出
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 所测的量 | 每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数（pfp/pfu） |
| 宿主菌株——洁净水 | 大肠埃希氏菌 C 菌株，ATCC 13706（饮用水、未受污染的天然水） |
| 宿主菌株——受污染的水 | 大肠埃希氏菌 CN 菌株，ATCC 700078（亦称 WG5）——对萘啶酸有抗性的突变株 |
| 噬菌体参照菌株 | 噬菌体 ΦX174，ATCC 13706-B1——用于制备参照物质 |
| 培养温度 | (36 ± 2) °C——培养箱或水浴；宿主菌株的培养需振荡，约 (100 ± 10) r/min。平板的培养时间见标准第 11 章，该章不在可取得的预览之内 |
| 波兰原水中的参照值 | 50 pfu/100 ml——超过即须在各处理阶段之后进行分析（《法律公报》2026 年第 748 项，附件 7 表 2） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską)
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe bakteriofagów — Część 2: Oznaczanie ilościowe colifagów somatycznych
- 标准名称（英语）
- Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 2: Enumeration of somatic coliphages
分步操作程序
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样品的采取与运输
按 ISO 8199 以及 ISO 5667-1、-2 和 -3 采样并送至实验室。在 NIZP–PZH 的实践中，样品按 PN-EN ISO 19458 采入加有硫代硫酸钠的无菌聚丙烯瓶，冷藏运输，并在 5 ± 3 °C 下保存不超过 48 h 至检验为止。
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宿主菌株的选择
对细菌含量低的样品（饮用水、未受污染的天然水）使用大肠埃希氏菌 C 菌株，ATCC 13706。对细菌数量大的样品（受污染的天然水、废水）使用对萘啶酸有抗性的突变株大肠埃希氏菌 CN 菌株，ATCC 700078（WG5）。
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宿主菌株的原始培养物
用巴斯德吸管把参照菌株冻干安瓿的内容物在约 3 ml MSB 肉汤中复溶，移入盛有 (50 ± 5) ml MSB 的 300 ml 锥形瓶，在轻微振荡下培养。加入 10 ml 无菌甘油（最终浓度 15—20 % 体积分数），混匀，按每份约 0.5 ml 分装入小瓶，并在 (−70 ± 10) °C 或液氮中保存。
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工作培养物与振荡
后续各阶段的培养均应在轻微振荡下进行——除生长更快外，这还能保证所有细胞都处于生长期，不会出现降低接种效率的稳定期细胞。没有振荡器时，应多次用手摇动接种培养物。
-
培养物密度测量的校准
把吸光度测量对活细胞数进行校准（标准第 10.2 章），使用带 500—650 nm 范围滤光片的分光光度计以及 1 cm 比色皿或带侧臂的比浊瓶。
-
样品的稀释
必要时用蛋白胨盐溶液或符合 ISO 6887 的其他稀释剂配制样品的稀释液。标准也允许把污泥和软体动物的浸提液经稀释后检验。
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双层倾注
把样品与少量半固体生长培养基混合，加入宿主菌株的培养物，并倾注在培养皿的固体培养基上。在器材方面，标准列出设定在 (45 ± 1) °C 的水浴或加热块以及另一台用于熔化琼脂培养基的水浴。
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培养与读板
把平板放入设定在 (36 ± 2) °C 的培养箱或水浴中培养，随后读板，在宿主细菌的密集菌苔中计数可见的噬菌斑。计数使用带间接斜射照明的计数器。
-
噬菌体数量少的样品
当预期的噬菌体数量很少时，必须对样品作预富集——标准为此指向另一份文件（ISO 10705-3，在波兰为 PN-EN ISO 10705-3，条例准许为此使用）。NIZP–PZH 在加入氯化镁使最终浓度达到 0.05 mol/l 之后，用纤维素酯滤膜对 100 ml 样品作膜过滤富集。
-
质量保证与结果
参照物质由噬菌体 ΦX174，ATCC 13706-B1 制备（标准第 8 章和 11.6.1）。结果表示为每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数（pfp/pfu）；为与条例的参照值比较，须换算为每 100 ml 原水。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| (36 ± 2) °C 的培养箱或水浴 | 另一台配振荡器，例如 (100 ± 10) r/min 的旋转平台，用于宿主菌株的培养 | — |
| (45 ± 1) °C 的水浴或加热块 | 标准列出设定在 (45 ± 1) °C 的水浴或加热块（7.4）以及另一台用于熔化琼脂培养基的水浴（7.5） | — |
| 500—650 nm 分光光度计 | 光程 1 cm 的比色皿或带侧臂的比浊瓶（250—300 ml）；带宽不大于 ±10 nm | — |
| 低温冰箱 | (−20 ± 5) °C 以及 (−70 ± 10) °C，或盛液氮的容器——用于保存原始培养物 | — |
| 带斜射照明的菌落计数器 | 标准要求使用带间接斜射照明的计数器（7.7） | — |
| 培养皿与实验室玻璃器皿 | 直径 9 cm 或 14—15 cm 的带通气培养皿、250—300 ml 锥形瓶、0.1/1/5/10 ml 吸管、用于去污的 0.2 µm 过滤装置 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| MSB 培养基（Modified Scholtens' Broth） | — | 按标准附录 A 的肉汤——用于复溶宿主菌株的冻干物以及用于原始培养物和工作培养物 |
| 半固体培养基与固体培养基 | — | 噬菌斑法的两层：样品与少量半固体培养基混合，全部混合物倾注在固体培养基上；组成按标准附录 A |
| 蛋白胨盐溶液 | — | 配制样品稀释液用的稀释剂（标准 A.7）或符合 ISO 6887 的其他稀释剂 |
| 萘啶酸 | — | 检验细菌本底高的样品时加入培养基——宿主菌株大肠埃希氏菌 CN（WG5）对它有抗性；NIZP–PZH 使用含萘啶酸的 ssMSA 培养基 |
| 无菌甘油 | — | 原始培养物的冷冻保护剂——冷冻前的最终浓度为 15—20 %（体积分数） |
| 硫代硫酸钠 | 7772-98-7 | 加入盛放经处理水样的瓶中——它中和残余的消毒剂；NIZP–PZH 按 PN-EN ISO 19458 使用它 |
职业健康与安全
- 本标准所用的宿主菌株对人和动物不致病——按细菌学实验室的一般安全程序处理即可
- 体细胞大肠菌噬菌体对人和动物同样不致病，但某些型别对干燥极为耐受——须防止受检物料的交叉污染
- 高滴度培养物的操作以及宿主菌株培养物的接种，应在生物安全柜中或实验室的专用区域内进行
- 氯仿是致癌物质——须采取相应的防护措施，或采用同样有效的替代方法
- 受检的地表水和废水样品含有粪源菌群——适用处理潜在感染性物料的一般规则（手套、工作服、废物去污）
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 10705-2:2005 (EN ISO 10705-2:2001 [IDT], ISO 10705-2:2000 [IDT]; zastępuje PN-EN ISO 10705-2:2002 — wersję angielską) — 《Water quality — Detection and enumeration of bacteriophages — Part 2: Enumeration of somatic coliphages》。
该方法的原理是什么？
把样品与少量半固体生长培养基混合。加入宿主菌株的培养物，并把全部混合物倾注在固体培养基上。
测量范围和准确度是多少？
所测的量：每一样品体积单位的噬菌斑形成颗粒数（pfp/pfu）；宿主菌株——洁净水：大肠埃希氏菌 C 菌株，ATCC 13706（饮用水、未受污染的天然水）；宿主菌株——受污染的水：大肠埃希氏菌 CN 菌株，ATCC 700078（亦称 WG5）——对萘啶酸有抗性的突变株；噬菌体参照菌株：噬菌体 ΦX174，ATCC 13706-B1——用于制备参照物质。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 10 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
(36 ± 2) °C 的培养箱或水浴、(45 ± 1) °C 的水浴或加热块、500—650 nm 分光光度计、低温冰箱、带斜射照明的菌落计数器、培养皿与实验室玻璃器皿。
该检测用于哪些场景？
按《法律公报》2026 年第 748 项对原水的运行监测——参照值 50 pfu/100 ml；就肠道病毒的去除评价水处理效能（经各道屏障之后的对数去除值）；自来水厂取水的地表水与地下水；废水和严重污染的水——使用对萘啶酸有抗性的宿主菌株；污泥和污水污泥浸提液（必要时经稀释）；软体动物浸提液——标准在适用范围中明确列出。
需要采取哪些安全防护措施？
本标准所用的宿主菌株对人和动物不致病——按细菌学实验室的一般安全程序处理即可；体细胞大肠菌噬菌体对人和动物同样不致病，但某些型别对干燥极为耐受——须防止受检物料的交叉污染；高滴度培养物的操作以及宿主菌株培养物的接种，应在生物安全柜中或实验室的专用区域内进行；氯仿是致癌物质——须采取相应的防护措施，或采用同样有效的替代方法；受检的地表水和废水样品含有粪源菌群——适用处理潜在感染性物料的一般规则（手套、工作服、废物去污）。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 10705-2。