🍎 肉中羟脯氨酸（胶原蛋白）——硫酸水解、氯胺T氧化、558 nm光度法
三句话速览
约4 g试样在3 mol/l硫酸中于105 °C水解16 h；过滤并稀释后，羟脯氨酸用氯胺T氧化，在60 °C下与对二甲氨基苯甲醛缩合，于558 nm测定红色产物的吸光度并对照校准曲线。该检测依据 PN-ISO 3496:2000；适用范围：羟脯氨酸含量 < 0.5 %（质量分数）的肉与制品。整个程序共 10 个步骤（合计约 17 小时 10 分钟）；主要用于：测定肉与肉制品（包括禽肉制品）中胶原蛋白（结缔组织）的含量、评价肉类原料与制品的质量（胶原蛋白与蛋白质之比）、肌内胶原蛋白嫩度与溶解性的研究（总胶原蛋白 = 羟脯氨酸 × 7.25）。
要点速览
- 标准: PN-ISO 3496:2000
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 17 小时 10 分钟
- 适用范围: 羟脯氨酸含量 < 0.5 %（质量分数）的肉与制品
- 水解: 30 ± 1 ml 3 mol/l H2SO4，105 °C下16 h
- 显色反应: 氯胺T于室温20 ± 1 min；显色试剂于60 °C ± 0.5 °C下20 min
概述
本标准规定了测定各类肉与肉制品（包括禽肉）中羟脯氨酸含量的方法，适用于羟脯氨酸含量低于0.5 %（质量分数）的样品。羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，因此其含量可用于计算结缔组织的含量：在牛肉肌肉的研究中，测得的羟脯氨酸乘以系数7.25换算为总胶原蛋白。本说明依据PN-ISO 3496:2000所采用的ISO 3496:1994的预览内容编写。
该方法包括：试样在硫酸中于105 °C水解，水解液过滤与稀释，用氯胺T氧化羟脯氨酸并与对二甲氨基苯甲醛生成红色化合物，于558 nm测定其吸光度。浓度由每批分析均重新绘制的校准曲线读取，该曲线由四个羟脯氨酸标准溶液（0.5、1、1.5和2 µg/ml）建立。
胶原蛋白含量对肉的嫩度和制品质量具有意义：在牛肉肌肉中，总胶原蛋白含量从0.4 %（背最长肌）到1.3 %（冈下肌）不等；羟脯氨酸也列入QAFP罐头行业分册的测定项目。
方法原理
称取约4 g试样（准确至0.001 g），加入30 ± 1 ml 3 mol/l硫酸，在105 °C烘箱中水解16 h（宜过夜进行）。将热的水解液过滤至250 ml容量瓶中，用10 ml热酸洗涤三次，加水定容。取V ml水解液稀释至250 ml，使羟脯氨酸浓度落在0.5～2 µg/ml范围内（依结缔组织量通常V = 5～25 ml）。向4.00 ml稀释液中加入2.00 ml氯胺T试剂（室温放置20 min），再加入2.00 ml含对二甲氨基苯甲醛的显色试剂，于60 °C水浴中准确加热20 min，冷却，30 min后在10 mm比色皿中以水为参比于558 ± 2 nm测定吸光度。羟脯氨酸含量：wh = 6.25·c/(m·V)（质量分数），其中c为由校准曲线得到的浓度（µg/ml），m为试样质量（g），V为所取水解液体积（ml）。结果准确至0.01 %。
应用领域
- 测定肉与肉制品（包括禽肉制品）中胶原蛋白（结缔组织）的含量
- 评价肉类原料与制品的质量（胶原蛋白与蛋白质之比）
- 肌内胶原蛋白嫩度与溶解性的研究（总胶原蛋白 = 羟脯氨酸 × 7.25）
- 肉类罐头的控制——该测定列入QAFP体系的方法目录
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 适用范围 | 羟脯氨酸含量 < 0.5 %（质量分数）的肉与制品 |
| 水解 | 30 ± 1 ml 3 mol/l H2SO4，105 °C下16 h |
| 显色反应 | 氯胺T于室温20 ± 1 min；显色试剂于60 °C ± 0.5 °C下20 min |
| 测定 | 558 ± 2 nm，10 mm玻璃比色皿，以水为参比；空白吸光度不应超过0.040 |
| 校准曲线 | 0.5、1、1.5和2 µg/ml四个羟脯氨酸溶液，每批分析重新绘制 |
| 精密度 | r = 0.0131 + 0.0322·wh；R = 0.0195 + 0.0529·wh（wh为平均值，质量分数） |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 3496:2000
- 标准名称（波兰语）
- Mięso i przetwory mięsne — Oznaczanie zawartości hydroksyproliny
- 标准名称（英语）
- Meat and meat products — Determination of hydroxyproline content
分步操作程序
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试样制备
将生鲜肉在低温下切成棱长约8 mm的小块，密封或真空包装后加热，使其在不低于70 °C下保持至少30 min（使结缔组织软化）；冷却后用绞肉机均质。熟制品直接均质。24 h内分析，并注意脂肪与液体分布均匀。
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称样
称取约4 g试样至水解瓶中，准确至0.001 g；确认物料未粘附于瓶壁。
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水解
加入30 ± 1 ml 3 mol/l硫酸，盖上表面皿，置于105 °C烘箱中16 h（宜过夜进行）。
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水解液过滤与稀释
将热水解液过滤至250 ml容量瓶中；用三份10 ml热的3 mol/l硫酸洗涤瓶与滤纸，洗液合并，加水定容并混匀。
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工作稀释
用移液管取V ml水解液至250 ml容量瓶中，V的选取应使稀释后羟脯氨酸浓度为0.5～2 µg/ml（依结缔组织量通常V = 5～25 ml）；加水定容。
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氯胺T氧化
取4.00 ml稀释液至试管中，加入2.00 ml氯胺T试剂，混匀并于室温放置20 ± 1 min。
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显色反应
加入2.00 ml显色试剂，仔细混匀，用铝箔或塑料膜封口，立即置于60 °C水浴中准确加热20 min。
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冷却与测定
将试管在流水下冷却至少3 min，于室温放置30 min，在10 mm玻璃比色皿中以水为参比于558 ± 2 nm测定吸光度。扣除空白（以水代替水解液的平行空白）的吸光度。
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校准曲线
对四个标准溶液各取4.00 ml，按第6～8步操作；以扣除空白后的吸光度对浓度作图，绘制通过各点与原点的最佳拟合直线。每批分析重新绘制曲线。
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计算
wh = 6.25·c/(m·V)，其中c为稀释水解液中羟脯氨酸浓度（µg/ml），m为试样质量（g），V为所取水解液体积（ml）。结果准确至0.01 %；若两次结果之差超过r = 0.0131 + 0.0322·wh，则两个结果均作废并重新测定。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 电动绞肉机 | 带水平刀具，高速 | — |
| 水解瓶 | 圆底或平底广口瓶，约200 ml，用5～6 cm表面皿盖住 | — |
| 烘箱 | 控温105 ± 1 °C | — |
| 水浴 | 能保持60 ± 0.5 °C | — |
| 分光光度计或光电比色计 | 可在558 ± 2 nm测定；光程10 mm的玻璃比色皿 | — |
| 分析天平、pH计、250 ml容量瓶、滤纸 | 称量精度0.001 g；直径12.5 cm的滤纸 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 硫酸，3 mol/l溶液 | 7664-93-9 | 将320 ml浓硫酸（密度1.84 g/ml）加入2 l容量瓶中的750 ml水里，冷却后定容 |
| pH 6.8缓冲液 | — | 将26.0 g一水柠檬酸、14.0 g氢氧化钠和78.0 g无水乙酸钠溶于500 ml水中，加入250 ml 1-丙醇，稀释至1 l；在4 °C避光可保存数周 |
| 氯胺T（N-氯代对甲苯磺酰胺钠盐三水合物） | 127-65-1 | 将1.41 g溶于100 ml缓冲液中；使用前临时配制 |
| 对二甲氨基苯甲醛 | 100-10-7 | 显色试剂：将10.0 g溶于35 ml 60 %（质量分数）高氯酸中，缓慢加入65 ml 2-丙醇；当日配制；必要时用70 %乙醇重结晶提纯 |
| 高氯酸60 %（质量分数） | 7601-90-3 | 显色试剂的组分 |
| 羟脯氨酸（反式-4-羟基-L-吡咯烷-2-甲酸） | 51-35-4 | 贮备液：50 mg溶于100 ml水中并加一滴硫酸（4 °C下至少可保存1个月）；使用当日取5 ml稀释至500 ml，再分别取10、20、30和40 ml稀释至100 ml——即0.5、1、1.5和2 µg/ml的标准溶液 |
职业健康与安全
- 3 mol/l硫酸与浓硫酸（配液时）——护目镜、手套、实验服；酸入水，热水解液过滤时须小心
- 显色试剂中的60 %高氯酸为强氧化剂——本操作以外不得与有机材料接触，应在通风橱内操作
- 对二甲氨基苯甲醛与氯胺T——避免吸入粉尘与皮肤接触
- 105 °C烘箱持续16 h——水解瓶应加盖表面皿，并戴隔热手套取出
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 3496:2000 — 《Meat and meat products — Determination of hydroxyproline content》。
该方法的原理是什么？
称取约4 g试样（准确至0.001 g），加入30 ± 1 ml 3 mol/l硫酸，在105 °C烘箱中水解16 h（宜过夜进行）。
测量范围和准确度是多少？
适用范围：羟脯氨酸含量 < 0.5 %（质量分数）的肉与制品；水解：30 ± 1 ml 3 mol/l H2SO4，105 °C下16 h；显色反应：氯胺T于室温20 ± 1 min；显色试剂于60 °C ± 0.5 °C下20 min；测定：558 ± 2 nm，10 mm玻璃比色皿，以水为参比；空白吸光度不应超过0.040。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 17 小时 10 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
电动绞肉机、水解瓶、烘箱、水浴、分光光度计或光电比色计、分析天平、pH计、250 ml容量瓶、滤纸。
该检测用于哪些场景？
测定肉与肉制品（包括禽肉制品）中胶原蛋白（结缔组织）的含量；评价肉类原料与制品的质量（胶原蛋白与蛋白质之比）；肌内胶原蛋白嫩度与溶解性的研究（总胶原蛋白 = 羟脯氨酸 × 7.25）；肉类罐头的控制——该测定列入QAFP体系的方法目录。
需要采取哪些安全防护措施？
3 mol/l硫酸与浓硫酸（配液时）——护目镜、手套、实验服；酸入水，热水解液过滤时须小心；显色试剂中的60 %高氯酸为强氧化剂——本操作以外不得与有机材料接触，应在通风橱内操作；对二甲氨基苯甲醛与氯胺T——避免吸入粉尘与皮肤接触；105 °C烘箱持续16 h——水解瓶应加盖表面皿，并戴隔热手套取出。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 3496。