🐟 鱼中组胺（HPLC）
采用丹磺酰氯衍生结合 UV 检测的 HPLC 法测定鱼和水产品中的组胺。鲭科鱼类的强制检验项目。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 19343:2017
- 类别: 食品化学
- 操作步骤数: 12
- 各步骤合计时间: 3 小时 27 分钟
- 分析物: 组胺（2-[4-咪唑基]乙胺）
- 定量限: 5–10 mg/kg
- 校准范围: 10–500 mg/kg
概述
组胺是一种生物胺，由鱼和水产品在储存不当（温度过高）时经细菌酶（组氨酸脱羧酶）使组氨酸脱羧生成。组胺中毒（鲭鱼毒素中毒）表现为头痛、荨麻疹、恶心和腹泻，严重时还会出现呼吸困难和血压下降。
欧盟法规（欧共体 2073/2005 号法规）要求对组氨酸含量高的鱼科进行组胺检验（鲭科 — 金枪鱼、鲭鱼、鲣鱼；鲱科 — 鲱鱼、沙丁鱼；鳀科 — 鳀鱼）。限量：9 个样品单元，m = 100 mg/kg（平均值上限），M = 200 mg/kg（任一样品不得超过）。对盐渍熟成鱼（鱼露、鳀鱼）：m = 200，M = 400 mg/kg。
ISO 19343 方法基于用高氯酸提取组胺、用丹磺酰氯（5-二甲氨基萘-1-磺酰氯）衍生、在 HPLC C18 色谱柱上反相分离，并在 254 nm 处进行 UV 检测。由于组胺没有强发色团，无法直接 UV 检测，因此必须进行丹磺酰化衍生。也可采用 OPA（邻苯二甲醛）衍生配荧光检测，或直接用 LC-MS/MS。
组胺耐热 — 烹煮、油炸或保藏均不能使其分解。因此唯一的预防途径是从捕捞到消费全程保持冷链。组胺检验是水产加工 HACCP 体系的关键环节。
方法原理
鱼样（10 g）用 0,4 mol/L 高氯酸经均质和离心提取。取上清液净化后用丹磺酰氯（dansyl-Cl）在碱性环境（pH 9–10，碳酸盐缓冲液）中进行柱前衍生。丹磺酰氯与组胺的氨基反应，生成有荧光/紫外吸收的丹磺酰-组胺衍生物。过量的丹磺酰氯用脯氨酸反应除去。生物胺衍生物在 C18 HPLC 柱上以乙腈/水梯度分离，并以 UV（254 nm）检测。组胺浓度依据校准曲线并使用内标（1,7-二氨基庚烷）计算。
应用领域
- 鲭科鱼类组胺强制控制（欧共体 2073/2005 号法规）
- 金枪鱼、鲭鱼、鲣鱼、鳀鱼、鲱鱼、沙丁鱼检验
- 鱼罐头和鱼制品控制（鱼酱、鱼露）
- 鳀鱼和盐渍熟成鱼监测
- 水产加工 HACCP 体系
- 鱼类冷链控制（新鲜度指标）
- RASFF（快速预警）计划框架内的食品检验
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 分析物 | 组胺（2-[4-咪唑基]乙胺） |
| 定量限 | 5–10 mg/kg |
| 校准范围 | 10–500 mg/kg |
| 欧盟限量（m） | 100 mg/kg（鲜鱼）、200 mg/kg（鱼露） |
| 欧盟限量（M） | 200 mg/kg（鲜鱼）、400 mg/kg（鱼露） |
| 衍生 | 丹磺酰氯（柱前）或 OPA（柱后） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 19343:2017
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe histaminy w rybach i przetworach rybnych — Metoda HPLC
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method
分步操作程序
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样品制备
将鱼样均质。称取 10 g 于 50 mL 离心管中。
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提取
加入 20 mL 0,4 mol/L 高氯酸。均质 2 min（Ultra-Turrax）。在 3000 rcf 下离心 10 min。
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衍生准备
取 1 mL 上清液于旋盖管中。加入 200 µL 内标溶液（1,7-二氨基庚烷）。
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碱化
加入 300 µL 饱和 NaHCO₃ 和 200 µL 2 mol/L NaOH。混匀。
-
丹磺酰氯衍生
加入 2 mL 丹磺酰氯（丙酮中 10 mg/mL）。涡旋混匀。40°C 孵育 45 min。
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除去过量丹磺酰氯
加入 100 µL L-脯氨酸溶液（100 mg/mL）。室温孵育 15 min。
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衍生物萃取
加入 2 mL 甲苯或乙酸乙酯。振荡 1 min。收集有机相。用 N₂ 吹干。
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样品复溶
用 200 µL 乙腈/水（60:40）溶解干残渣。涡旋混匀。过滤至 HPLC 小瓶。
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HPLC 分析
进样 20 µL 至 C18 色谱柱。梯度：25 min 内 MeCN 由 50→95%。UV 检测 254 nm。流速 1 mL/min。
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定量
计算组胺/内标峰面积比。由校准曲线读取浓度。计入稀释倍数。
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结果判读
与欧盟限量比较：n=9，c=2，m=100 mg/kg，M=200 mg/kg（鲜鱼）。任一样品不得超过 M。
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质量控制
每批：空白、加标（50 和 200 mg/kg）、CRM（FAPAS）。回收率 80–110%，RSD < 15%。参加能力验证。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统 | Shimadzu Nexera + SPD-M40、Agilent 1260 + DAD、Waters Alliance + PDA | 120 000–300 000 PLN |
| HPLC C18 色谱柱 | Waters Symmetry C18（250 × 4,6 mm，5 µm）、Phenomenex Luna C18 | 1 500–3 000 PLN |
| 均质机 | IKA Ultra-Turrax T25、Kinematica Polytron PT 2500E | 5 000–15 000 PLN |
| 实验室离心机 | Hettich Rotina 380 R、Eppendorf 5810 R（≥3000 rcf） | 15 000–40 000 PLN |
| 40°C 水浴 | Memmert WNB 7、Julabo TW 12 | 3 000–8 000 PLN |
| 通风柜 / 排风橱 | 用于丹磺酰氯和高氯酸的操作 | 15 000–40 000 PLN |
| 分析天平 0,1 mg | Mettler Toledo ME204、Radwag AS 220.R2 | 8 000–20 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 二盐酸组胺（标准品） | 56-92-8 | 校准标准，有证 CRM，1 g |
| 丹磺酰氯（dansyl-Cl） | 605-65-2 | 衍生试剂，5-二甲氨基萘-1-磺酰氯，1 g |
| 高氯酸 0,4 mol/L | 7601-90-3 | 从样品中提取组胺，500 mL |
| 1,7-二氨基庚烷（内标） | 646-19-5 | 内标 IS，5 g |
| 碳酸盐缓冲液 pH 9–10 | — | 衍生反应环境（NaHCO₃/Na₂CO₃） |
| L-脯氨酸 | 147-85-3 | 衍生后除去过量丹磺酰氯，25 g |
| 乙腈 HPLC 级 | 75-05-8 | 流动相及溶剂，2,5 L |
| HPLC 级水（超纯） | — | 流动相，Milli-Q 系统（18,2 MΩ·cm） |
职业健康与安全
- 高氯酸 — 强氧化剂（H271、H314）。与有机材料接触有爆炸风险。佩戴手套和护目镜。
- 丹磺酰氯 — 有刺激性（H315、H319）。在通风柜中操作。避免吸入蒸气。
- 乙腈 — 易燃且有毒。在通风柜中操作。
- 甲苯 — 易燃且有毒（H225、H304、H315、H336、H361d、H373）。在通风柜中操作。
- 鱼样 — 可能含病原菌。佩戴手套。按生物废物处置。
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 19343:2017 — 《Microbiology of the food chain — Detection and quantification of histamine in fish and fishery products — HPLC method》。
该方法的原理是什么？
鱼样（10 g）用 0,4 mol/L 高氯酸经均质和离心提取。取上清液净化后用丹磺酰氯（dansyl-Cl）在碱性环境（pH 9–10，碳酸盐缓冲液）中进行柱前衍生。
测量范围和准确度是多少？
分析物：组胺（2-[4-咪唑基]乙胺）；定量限：5–10 mg/kg；校准范围：10–500 mg/kg；欧盟限量（m）：100 mg/kg（鲜鱼）、200 mg/kg（鱼露）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 3 小时 27 分钟。整个程序共 12 个步骤。
需要哪些设备？
带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统、HPLC C18 色谱柱、均质机、实验室离心机、40°C 水浴、通风柜 / 排风橱、分析天平 0,1 mg。核心仪器的参考价格（带 UV/DAD 检测器的 HPLC 系统）：120 000–300 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
鲭科鱼类组胺强制控制（欧共体 2073/2005 号法规）；金枪鱼、鲭鱼、鲣鱼、鳀鱼、鲱鱼、沙丁鱼检验；鱼罐头和鱼制品控制（鱼酱、鱼露）；鳀鱼和盐渍熟成鱼监测；水产加工 HACCP 体系；鱼类冷链控制（新鲜度指标）；RASFF（快速预警）计划框架内的食品检验。
需要采取哪些安全防护措施？
高氯酸 — 强氧化剂（H271、H314）。与有机材料接触有爆炸风险。佩戴手套和护目镜。；丹磺酰氯 — 有刺激性（H315、H319）。在通风柜中操作。避免吸入蒸气。；乙腈 — 易燃且有毒。在通风柜中操作。；甲苯 — 易燃且有毒（H225、H304、H315、H336、H361d、H373）。在通风柜中操作。；鱼样 — 可能含病原菌。佩戴手套。按生物废物处置。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 19343。