🦠 食品中的凝固酶阳性葡萄球菌——少量菌的检出和最可能数法MPN（Giolitti-Cantoni肉汤）
三句话速览
把样品或稀释液接种到含亚碲酸钾的改良Giolitti-Cantoni肉汤中，在37 °C下厌氧培养24 h和48 h；从亚碲酸盐被还原（变黑）的试管转接到Baird-Parker琼脂（37 °C，24–48 h）或RPFA上，确证凝固酶并由表格读出检出结果或MPN——该方法用于葡萄球菌受损伤且数量很少的干燥产品。该检测依据 PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003)；增菌：含亚碲酸钾的改良Giolitti-Cantoni肉汤；37 °C厌氧（琼脂／石蜡塞或厌氧罐）；在24 h和48 h读数。整个程序共 6 个步骤；主要用于：葡萄球菌受损伤且数量很少的干燥产品和水分活度低的产品（乳粉、香辛料、浓缩制品）、在规定量的产品（如1 g、10 g）中检出凝固酶阳性葡萄球菌、计数低于平板法ISO 6888-1/-2定量限的少量菌。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 增菌: 含亚碲酸钾的改良Giolitti-Cantoni肉汤；37 °C厌氧（琼脂／石蜡塞或厌氧罐）；在24 h和48 h读数
- 肉汤中的指示: 亚碲酸钾被还原（变黑）= 推定葡萄球菌
- 分离: Baird-Parker琼脂37 °C，24 h和48 h（亚碲酸盐还原 + 与蛋黄的反应）或RPF琼脂
概述
ISO 6888-3:2003规定了用最可能数法（MPN）在供人食用和动物饲用的产品以及来自食品生产和流通的环境样品中计数和检出凝固酶阳性葡萄球菌的水平法。推荐用于葡萄球菌可能受损伤（受胁迫）且数量很少的产品，例如干燥产品。凝固酶阳性葡萄球菌主要是Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌），但S. intermedius和S. hyicus的某些菌株也产生凝固酶。它们被定义为在选择性培养基表面形成典型和／或非典型菌落、凝固酶反应阳性或在RPF琼脂上与兔血浆呈特异性反应的细菌；确证基于明显阳性的凝固酶反应，弱阳性的菌株则用附加试验（如耐热核酸酶，IDF 83）加以区分。在UWM（瓦尔米亚－马祖里大学）的讲义中，该方法被列为葡萄球菌的“检出或MPN测定”：接种Giolitti-Cantoni培养基，做3个重复（材料为10 cm³时用双倍浓度），37 °C/24–48 h厌氧，变黑 = 阳性结果，在RPF或Baird-Parker上确证。该标准发布时带有一处更正（第9.1.1条）；在波兰它以PN-EN ISO 6888-3:2004施行。
方法原理
检出：用规定量的液体样品或初始悬液接种选择性液体培养基，在37 °C下厌氧培养24 h和48 h——亚碲酸钾的还原表明有推定的凝固酶阳性葡萄球菌（厌氧条件通过在每支试管中加琼脂或石蜡塞、或在厌氧罐／厌氧培养箱中培养实现）。24 h后从阳性试管、48 h后从其余试管，接种到Baird-Parker琼脂表面并在37 °C下培养24 h和48 h——亚碲酸盐的还原和与蛋黄的反应表明为推定葡萄球菌；典型和非典型菌落用凝固酶反应加以确证。作为替代，也可接种到兔血浆纤维蛋白原琼脂上，在其上呈特异性反应的菌落即为确证。结果：在x g或x ml中“检出／未检出”。计数：把产品的系列稀释液接种到选择性液体培养基中，按上述操作，再按经确证的稀释度由表格读出每g或每ml的MPN。改良Giolitti-Cantoni肉汤（基础培养基，每1000 ml；单倍浓度／双倍浓度）：酪蛋白水解物10/20 g、肉浸膏5/10 g、酵母浸膏5/10 g、氯化锂5/10 g、甘露醇20/40 g、NaCl 5/10 g、甘氨酸1.2/2.4 g、丙酮酸钠3/6 g、Tween 80 1/2 g；向培养基中加入亚碲酸钾溶液（第5章的后续部分）。稀释液按ISO 6887、ISO 8261或产品标准。
应用领域
- 葡萄球菌受损伤且数量很少的干燥产品和水分活度低的产品（乳粉、香辛料、浓缩制品）
- 在规定量的产品（如1 g、10 g）中检出凝固酶阳性葡萄球菌
- 计数低于平板法ISO 6888-1/-2定量限的少量菌
- 来自食品生产和流通的环境样品
- 饲料
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 增菌 | 含亚碲酸钾的改良Giolitti-Cantoni肉汤；37 °C厌氧（琼脂／石蜡塞或厌氧罐）；在24 h和48 h读数 |
| 肉汤中的指示 | 亚碲酸钾被还原（变黑）= 推定葡萄球菌 |
| 分离 | Baird-Parker琼脂37 °C，24 h和48 h（亚碲酸盐还原 + 与蛋黄的反应）或RPF琼脂 |
| 确证 | 凝固酶反应（典型和非典型菌落）或在RPFA上的特异性反应；弱阳性——耐热核酸酶 |
| 结果 | 在x g或ml中检出／未检出；按经确证的稀释度由表格查得每g或每ml的MPN |
| 基础培养基（每1 l，单倍浓度） | 酪蛋白水解物10 g、肉浸膏5 g、酵母浸膏5 g、LiCl 5 g、甘露醇20 g、NaCl 5 g、甘氨酸1.2 g、丙酮酸钠3 g、Tween 80 1 g |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 3: Wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 3: Detection and MPN technique for low numbers
分步操作程序
-
样品
按ISO 6887（相应部分）、ISO 8261或产品标准制备初始悬液和稀释液。
-
接种肉汤
检出：把规定量的液体样品或初始悬液加入一支选择性肉汤试管（材料为10 ml时用双倍浓度）。计数：把系列稀释液接种到肉汤试管中（实践中每个稀释度3支试管）。
-
厌氧培养
保证厌氧条件（琼脂或石蜡塞，或厌氧罐／厌氧培养箱）并在37 °C下培养；在24 h和48 h判定——变黑（亚碲酸盐还原）表示该试管推定为阳性。
-
接种固体培养基
24 h后从阳性试管、48 h后从其余所有试管表面接种到Baird-Parker琼脂上（37 °C，24 h和48 h）——有亚碲酸盐还原和与蛋黄反应的菌落为推定菌落；作为替代接种到RPFA上，在其上与血浆的特异性反应即为确证。
-
确证
把Baird-Parker上的典型和非典型菌落用凝固酶反应确证（按UWM：0.1 cm³肉汤培养物 + 0.3 cm³兔血浆，37 °C，4–6 h后读数，阴性时——再过24 h读数）；反应微弱时——做耐热核酸酶试验。
-
结果
检出：在x g或ml中检出／未检出。计数：按各稀释度中经确证的试管数由表格读出每g或每ml的MPN。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱37 °C | — | |
| 厌氧罐或厌氧培养箱（或用琼脂／石蜡塞代替） | 试管中的厌氧条件 | — |
| 盛有单倍浓度和双倍浓度肉汤的试管、移液管 | 每个稀释度3支试管的布局（UWM） | — |
| Baird-Parker琼脂或RPFA平板 | 分离和确证 | — |
| 凝固酶试验用试管、培养箱37 °C | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 改良Giolitti-Cantoni肉汤（基础培养基 + 亚碲酸钾溶液） | — | 厌氧条件下葡萄球菌的选择性增菌 |
| Baird-Parker琼脂（含亚碲酸盐和蛋黄）或兔血浆纤维蛋白原琼脂 | — | 分离和初步鉴定 |
| 兔血浆 | — | 凝固酶试验（确证） |
| 按ISO 6887／ISO 8261的稀释液 | — | 初始悬液和稀释液 |
职业健康与安全
- 凝固酶阳性葡萄球菌产生肠毒素——须在配备适当的实验室中、在微生物学专业人员监督下操作，并仔细处置材料
- 亚碲酸钾有毒——戴手套，避免扬尘；氯化锂——避免接触
- 带产气装置的厌氧罐——按制造商说明使用；石蜡——加塞时温度高
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 6888-3:2004 (ISO 6888-3:2003) — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 3: Detection and MPN technique for low numbers》。
该方法的原理是什么？
检出：用规定量的液体样品或初始悬液接种选择性液体培养基，在37 °C下厌氧培养24 h和48 h——亚碲酸钾的还原表明有推定的凝固酶阳性葡萄球菌（厌氧条件通过在每支试管中加琼脂或石蜡塞、或在厌氧罐／厌氧培养箱中培养实现）。24 h后从阳性试管、48 h后从其余试管，接种到Baird-Parker琼脂表面并在37 °C下培养24 h和48 h——亚碲酸盐的还原和与蛋黄的反应表明为推定葡萄球菌；典型和非典型菌落用凝固酶反应加以确证。
测量范围和准确度是多少？
增菌：含亚碲酸钾的改良Giolitti-Cantoni肉汤；37 °C厌氧（琼脂／石蜡塞或厌氧罐）；在24 h和48 h读数；肉汤中的指示：亚碲酸钾被还原（变黑）= 推定葡萄球菌；分离：Baird-Parker琼脂37 °C，24 h和48 h（亚碲酸盐还原 + 与蛋黄的反应）或RPF琼脂；确证：凝固酶反应（典型和非典型菌落）或在RPFA上的特异性反应；弱阳性——耐热核酸酶。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱37 °C、厌氧罐或厌氧培养箱（或用琼脂／石蜡塞代替）、盛有单倍浓度和双倍浓度肉汤的试管、移液管、Baird-Parker琼脂或RPFA平板、凝固酶试验用试管、培养箱37 °C。
该检测用于哪些场景？
葡萄球菌受损伤且数量很少的干燥产品和水分活度低的产品（乳粉、香辛料、浓缩制品）；在规定量的产品（如1 g、10 g）中检出凝固酶阳性葡萄球菌；计数低于平板法ISO 6888-1/-2定量限的少量菌；来自食品生产和流通的环境样品；饲料。
需要采取哪些安全防护措施？
凝固酶阳性葡萄球菌产生肠毒素——须在配备适当的实验室中、在微生物学专业人员监督下操作，并仔细处置材料；亚碲酸钾有毒——戴手套，避免扬尘；氯化锂——避免接触；带产气装置的厌氧罐——按制造商说明使用；石蜡——加塞时温度高。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 6888-3。