🦠 食品中的凝固酶阳性葡萄球菌——兔血浆纤维蛋白原琼脂（RPFA）平板法
三句话速览
取1 ml样品或初始悬液作倾注接种并倒入18–20 ml RPF琼脂（兔血浆纤维蛋白原）；在34–38 °C下需氧培养24 h ± 2 h（必要时至48 h ± 4 h）后，计数周围有混浊沉淀区、表明有凝固酶活性的黑色、灰色或白色小菌落——无需另行确证；它是第2073/2005号条例（欧共体）中干酪的参比方法。该检测依据 PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021)；培养：需氧，34–38 °C（35 ± 1、36 ± 2或37 ± 1 °C）；24 h ± 2 h，没有典型菌落时共48 h ± 4 h。整个程序共 6 个步骤；主要用于：生乳干酪的过程卫生判据（参比方法EN/ISO 6888-2）以及其他干酪、乳粉和乳清粉、甲壳动物和软体动物产品（6888-1或2）——第2073/2005号条例（欧共体）、肉制品、熟食制品、奶油蛋糕、冰淇淋——生产卫生和葡萄球菌肠毒素风险的评价、来自食品和饲料生产以及初级生产的环境样品。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 培养: 需氧，34–38 °C（35 ± 1、36 ± 2或37 ± 1 °C）；24 h ± 2 h，没有典型菌落时共48 h ± 4 h
- 培养基: 兔血浆纤维蛋白原琼脂（RPFA），每块平板18–20 ml（层厚 ≥ 3 mm），倾注时44–47 °C
- 典型菌落: 黑色／灰色／白色小菌落，带混浊沉淀区（凝固酶）——无需确证
概述
ISO 6888-1、ISO 6888-2和ISO 6888-3描述了检出和计数凝固酶阳性葡萄球菌的三种水平法，这类细菌中存在产肠毒素的菌株——首先是Staphylococcus aureus（金黄色葡萄球菌），但也有S. intermedius和S. hyicus的某些菌株。其特征基于凝固酶反应阳性；反应弱阳性的菌株可能与其他细菌混淆，须用附加试验（对溶葡萄球菌素的敏感性、溶血素、耐热核酸酶、由甘露醇产酸）加以区分。ISO 6888-2:2021（第二版，取代带Amd 1:2003的ISO 6888-2:1999）规定了在兔血浆纤维蛋白原琼脂上于34–38 °C需氧培养后计数菌落的方法；它适用于供人食用和动物饲用的产品、食品和饲料生产的环境样品以及来自初级生产的样品。相对于上一版的变化有：培养基在44–47 °C下倾注（按ISO 7218）、温度范围为34–38 °C而不是“35 °C或37 °C”、时间为24 h ± 2 h而不是18–24 h、要求采用ISO 11133并对RPFA培养基作性能试验；这些变化被认定为轻微。对于带有Staphylococcus spp.工艺菌群的发酵产品（如S. xylosus——生乳干酪、某些生肉制品）、受在Baird-Parker上形成非典型菌落的葡萄球菌污染的产品或带有掩盖菌落菌群的产品，该方法被认为并非完全适用；ISO 6888-1和ISO 6888-2具有同等地位。第2073/2005号条例（欧共体）指明EN/ISO 6888-2为生乳干酪（10⁴–10⁵ CFU/g）过程卫生判据的参比方法，并对巴氏杀菌乳干酪、新鲜干酪、乳粉和乳清粉、软体动物和甲壳动物产品指明“EN/ISO 6888-1或2”（> 10⁵ CFU/g时检验肠毒素）。
方法原理
用规定量的液体样品或初始悬液以及十倍稀释液以倾注法制备平板（平板数按ISO 7218）；加入接种物中的RPFA培养基体积是凝固酶反应的关键点——应立即向每块平板中倒入18–20 ml新鲜配制的完全培养基（B.2.3），以获得至少3 mm的层厚。平板在34–38 °C下需氧培养（培养箱设定为35 °C ± 1 °C、36 °C ± 2 °C或37 °C ± 1 °C），24 h ± 2 h后判定，并在皿底标出典型菌落的位置；若没有典型菌落——再培养至总计48 h ± 4 h。典型菌落为黑色、灰色甚至白色的小菌落，周围有表明凝固酶活性的混浊沉淀区；Proteus的菌落起初可能与之相似，但在24–48 h后变褐并蔓延。由于该培养基基于凝固酶反应，无需确证；尽管RPFA中含有胰蛋白酶抑制剂，24 h后的典型菌落到48 h时仍可能失去典型外观（胰蛋白酶、过度生长），因此只在48 h后计数可能使结果偏低。计数时保留菌落最多300个、其中典型菌落100个的平板；一块平板必须至少有10个菌落；数量接近定量限时建议做双份（合计 ≥ 10个菌落，相当于 > 5 CFU/ml或 > 50 CFU/g）。结果按ISO 7218计算为CFU/g、CFU/ml、CFU/cm²或每件采样器具；培养基的组成和性能试验——附录B／ISO 11133；来自实验室间研究（干酪、肉、蛋粉、标准物质）的精密度——附录C。按UWM（瓦尔米亚－马祖里大学）讲义，菌落周围的混浊是凝固酶与血浆中凝血酶原反应的结果——生成的葡萄球菌凝血酶与纤维蛋白原形成聚合物并在菌落周围析出。
应用领域
- 生乳干酪的过程卫生判据（参比方法EN/ISO 6888-2）以及其他干酪、乳粉和乳清粉、甲壳动物和软体动物产品（6888-1或2）——第2073/2005号条例（欧共体）
- 肉制品、熟食制品、奶油蛋糕、冰淇淋——生产卫生和葡萄球菌肠毒素风险的评价
- 来自食品和饲料生产以及初级生产的环境样品
- 作为Baird-Parker琼脂（ISO 6888-1）的替代，无需在试管中确证凝固酶的步骤
- 饲料和原料
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养 | 需氧，34–38 °C（35 ± 1、36 ± 2或37 ± 1 °C）；24 h ± 2 h，没有典型菌落时共48 h ± 4 h |
| 培养基 | 兔血浆纤维蛋白原琼脂（RPFA），每块平板18–20 ml（层厚 ≥ 3 mm），倾注时44–47 °C |
| 典型菌落 | 黑色／灰色／白色小菌落，带混浊沉淀区（凝固酶）——无需确证 |
| 计数 | 平板 ≤ 300个菌落，其中典型菌落 ≤ 100个；一块平板 ≥ 10个菌落；数量低时做双份（合计 ≥ 10） |
| 法定判据（2073/2005） | 生乳干酪m = 10⁴、M = 10⁵ CFU/g；巴氏杀菌干酪、乳粉：m = 10、M = 100 CFU/g；> 10⁵ CFU/g → 检验肠毒素 |
| 局限 | 带Staphylococcus spp.菌群（S. xylosus）的发酵产品、形成非典型菌落的葡萄球菌、掩盖性菌群 |
| 结果 | CFU/g、CFU/ml、CFU/cm²或每件采样器具（ISO 7218） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków) — Część 2: Metoda z zastosowaniem pożywki agarowej z plazmą króliczą i fibrynogenem
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium
分步操作程序
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样品
按ISO 6887系列制备样品、初始悬液（10⁻¹）和稀释液（表面——ISO 18593；采样：食品ISO/TS 17728、乳ISO 707、胴体ISO 17604、初级生产ISO 13307）。
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倾注接种
用无菌移液管把1 ml液体样品或初始悬液（以及后续稀释液）移入按ISO 7218确定数量的培养皿中。
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倒入RPFA
立即向每块平板中倒入18–20 ml新鲜配制的完全RPFA培养基（44–47 °C），以获得 ≥ 3 mm的层厚；小心混匀并置于水平面上待其凝固。
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培养
把平板倒置于34–38 °C培养24 h ± 2 h；在皿底标出典型菌落。如果没有菌落或没有典型菌落——再培养24 h ± 2 h（共48 h ± 4 h）并标出新的典型菌落。
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计数
计数典型菌落（黑色、灰色或白色小菌落，带混浊沉淀区）；把Proteus区分开（变褐、蔓延）。保留菌落 ≤ 300个、其中典型菌落 ≤ 100个的平板，且一块平板 ≥ 10个菌落；数量低时用双份（合计 ≥ 10）。
-
结果
按ISO 7218计算凝固酶阳性葡萄球菌数，以CFU/g、CFU/ml、CFU/cm²或每件采样器具表示；没有菌落时——按ISO 7218对特殊情形的规定给出结果；与2073/2005的判据比较。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱34–38 °C | 设定35 °C ± 1 °C、36 °C ± 2 °C或37 °C ± 1 °C | — |
| 水浴44–47 °C | 维持培养基熔化状态 | — |
| 约90 mm无菌培养皿 | 玻璃或塑料 | — |
| 带棉塞的1、2和10 ml移液管（分度0.1/0.1/0.5 ml） | 或自动移液器 | — |
| 带温度补偿的pH计（0.01；± 0.1）、冰箱5 °C ± 3 °C、0.2 µm滤膜 | 血浆／纤维蛋白原的过滤除菌 | — |
| 高压灭菌器和干燥箱 | 按ISO 7218 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 兔血浆纤维蛋白原琼脂（RPFA）——基础培养基 + 兔血浆 + 纤维蛋白原 + 胰蛋白酶抑制剂（组成和制备见附录B） | — | 带直接凝固酶反应的选择性－鉴别性培养基 |
| 按ISO 6887（相应部分）的稀释液 | — | 初始悬液和稀释液 |
| 用于培养基性能试验的对照菌株（ISO 11133） | — | RPFA的产率和选择性 |
职业健康与安全
- 凝固酶阳性葡萄球菌可产生肠毒素——须在配备适当的实验室中、在微生物学专业人员监督下检验，并仔细处置培养后的材料
- 兔血浆和纤维蛋白原——动物源材料，经过滤除菌，冷藏保存
- 44–47 °C的热琼脂——注意防止烫伤
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 6888-2:2022-03 (ISO 6888-2:2021) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 2: Method using rabbit plasma fibrinogen agar medium》。
该方法的原理是什么？
用规定量的液体样品或初始悬液以及十倍稀释液以倾注法制备平板（平板数按ISO 7218）；加入接种物中的RPFA培养基体积是凝固酶反应的关键点——应立即向每块平板中倒入18–20 ml新鲜配制的完全培养基（B.2.
测量范围和准确度是多少？
培养：需氧，34–38 °C（35 ± 1、36 ± 2或37 ± 1 °C）；24 h ± 2 h，没有典型菌落时共48 h ± 4 h；培养基：兔血浆纤维蛋白原琼脂（RPFA），每块平板18–20 ml（层厚 ≥ 3 mm），倾注时44–47 °C；典型菌落：黑色／灰色／白色小菌落，带混浊沉淀区（凝固酶）——无需确证；计数：平板 ≤ 300个菌落，其中典型菌落 ≤ 100个；一块平板 ≥ 10个菌落；数量低时做双份（合计 ≥ 10）。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱34–38 °C、水浴44–47 °C、约90 mm无菌培养皿、带棉塞的1、2和10 ml移液管（分度0.1/0.1/0.5 ml）、带温度补偿的pH计（0.01；± 0.1）、冰箱5 °C ± 3 °C、0.2 µm滤膜、高压灭菌器和干燥箱。
该检测用于哪些场景？
生乳干酪的过程卫生判据（参比方法EN/ISO 6888-2）以及其他干酪、乳粉和乳清粉、甲壳动物和软体动物产品（6888-1或2）——第2073/2005号条例（欧共体）；肉制品、熟食制品、奶油蛋糕、冰淇淋——生产卫生和葡萄球菌肠毒素风险的评价；来自食品和饲料生产以及初级生产的环境样品；作为Baird-Parker琼脂（ISO 6888-1）的替代，无需在试管中确证凝固酶的步骤；饲料和原料。
需要采取哪些安全防护措施？
凝固酶阳性葡萄球菌可产生肠毒素——须在配备适当的实验室中、在微生物学专业人员监督下检验，并仔细处置培养后的材料；兔血浆和纤维蛋白原——动物源材料，经过滤除菌，冷藏保存；44–47 °C的热琼脂——注意防止烫伤。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 6888-2。