🦠 凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）
采用表面涂布法在含蛋黄乳液和亚碲酸钾的 Baird-Parker 琼脂上计数食品中的凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 6888-1:2022
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 2 天 1 小时 20 分钟–3 天 1 小时 20 分钟
- 培养温度: 34–38°C（最佳 37°C）
- 培养时间: 24 ± 2 h（初读）+ 48 ± 4 h（终读）
- 培养基: Baird-Parker 琼脂 + 含亚碲酸钾的蛋黄乳液
概述
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球最常见的细菌性食物中毒病因之一。凝固酶阳性葡萄球菌产生耐热肠毒素（SE A–E），即使食品经热处理也不会被破坏。仅约 100 ng 肠毒素即足以引起人体中毒症状。食品污染源多为生产人员（鼻腔带菌、手部感染性伤口）。
PN-EN ISO 6888-1 标准描述了使用选择性 Baird-Parker 培养基计数凝固酶阳性葡萄球菌的水平法。培养基含亚碲酸钾和氯化锂作为伴随菌抑制剂，同时甘氨酸和丙酮酸钠促进葡萄球菌生长。金黄色葡萄球菌在该培养基上形成黑色或灰色、有光泽的凸起菌落，周围有透明圈（亚碲酸盐被还原为金属碲）。
该方法在全球被作为食品中葡萄球菌计数的金标准使用。它可依据菌落形态同时完成计数和初步鉴定。确证采用试管凝固酶试验或 RPFA（兔血浆纤维蛋白原琼脂）法。
按（EC）2073/2005 号法规，奶酪、乳粉、即食产品和婴幼儿食品必须进行该检验。它是乳品、糕点和餐饮企业 HACCP 体系的关键环节。
方法原理
方法是将样品表面涂布于加有蛋黄乳液和亚碲酸钾的选择性 Baird-Parker 培养基上。亚碲酸钾（K₂TeO₃）被葡萄球菌还原为金属碲，使菌落呈特征性黑色。氯化锂和亚碲酸盐抑制大多数伴随菌的生长。金黄色葡萄球菌产生的卵磷脂酶使菌落周围出现透明圈。脂肪酶分解蛋黄脂肪，形成外层沉淀环。在 34–38°C 培养 24–48 h 后，对典型菌落进行凝固酶试验确证。
应用领域
- 奶酪和乳制品质量控制
- 即食（RTE）食品检验 — （EC）2073/2005 号法规标准
- 糕点房和餐饮企业生产卫生监测
- 婴幼儿食品控制
- 肉类及肉制品检验
- 人员手部和工作台面涂抹样检验（GHP）
- 流行病学调查中的食品分析（食物中毒）
- 热处理和保藏工艺有效性验证
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养温度 | 34–38°C（最佳 37°C） |
| 培养时间 | 24 ± 2 h（初读）+ 48 ± 4 h（终读） |
| 培养基 | Baird-Parker 琼脂 + 含亚碲酸钾的蛋黄乳液 |
| 菌落特征 | 黑色/灰色、有光泽、凸起，周围有透明圈 |
| 接种方式 | 表面涂布，每皿 0,1–0,3 mL |
| 确证 | 试管凝固酶试验（兔血浆） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 6888-1:2022
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i inne gatunki) — Część 1: Metoda z zastosowaniem podłoża agarowego Baird-Parkera
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium
分步操作程序
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样品制备
称取 10 g（或 25 g）样品于均质袋中。加入 90 mL（或 225 mL）缓冲蛋白胨水。均质 60–120 s。
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制备稀释系列
制备十倍稀释系列（10⁻²、10⁻³）。每个稀释度更换新吸头。
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培养基制备
将 Baird-Parker 琼脂基础溶于蒸馏水。121°C 灭菌 15 min。冷却至 47–50°C 后无菌加入含亚碲酸盐的蛋黄乳液。倾入平皿（约 18–20 mL）。烘干平板。
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表面涂布
取 0,1 mL（同一稀释度在 3 个平板上合计不超过 0,3 mL）加于培养基表面。用涂布棒均匀涂布整个表面。
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接种物吸收
将平板敞开置于生物安全柜中，直至接种物被吸收（约 15 min）。
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培养
将平板倒置，于 34–38°C 培养。24 ± 2 h 初读并标记典型菌落，继续培养至 48 ± 4 h。
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菌落读取
计数典型菌落（黑色/灰色、有光泽、凸起，周围有透明圈和/或乳浊环）。同时标记非典型菌落（黑色但无圈）。
-
凝固酶试验（确证）
挑取至少 5 个典型和 5 个非典型菌落。接种于 0,3 mL BHI 肉汤，37°C 培养 24 h。加入 0,3 mL 兔血浆。37°C 培养并于 4–6 h（最长 24 h）观察凝块形成。
-
计算
结合确证菌落的百分比计算凝固酶阳性葡萄球菌数。结果以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。
-
质量控制
阳性对照：S. aureus ATCC 25923（典型菌落）。阴性对照：E. coli ATCC 25922（不生长或非典型菌落）。培养基无菌性对照。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 37°C 实验室培养箱 | Binder BD 56、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator、Interscience BagMixer | 12 000–25 000 PLN |
| 47–50°C 水浴 | Memmert WNB 14、Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| 涂布棒（L 棒） | 玻璃或一次性塑料，无菌 | 50–200 PLN / 100 支 |
| 0,1–1 mL 移液器 | Eppendorf Research Plus、Gilson Pipetman | 400–1 200 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Baird-Parker 琼脂基础 | 7790-58-1 | 选择性培养基基础：胰蛋白胨、肉浸粉、酵母浸粉、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂；500 g 装 |
| 含亚碲酸钾的蛋黄乳液（EYT） | 7790-58-1 | Baird-Parker 琼脂补充剂；50 mL 蛋黄乳液 + 0,5% 亚碲酸钾；100 mL 装 |
| 丙酮酸钠 | 113-24-6 | 中和有毒过氧化物的生长因子，培养基组分 |
| 氯化锂 | 7447-41-8 | 抑制伴随菌生长的选择性成分 |
| 兔血浆 | — | 用于试管凝固酶试验（确证），冻干品，10 × 3 mL 装 |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于制备初始悬液和稀释液，500 g 装 |
| BHI 肉汤（脑心浸液） | — | 凝固酶试验前的分离株增菌，500 g 装 |
职业健康与安全
- 金黄色葡萄球菌 — BSL-2 病原菌，须使用全套个人防护装备
- 亚碲酸钾 — 有毒，避免吸入和皮肤接触，在生物安全柜中操作
- 所有敞开样品的操作均须在 II 级生物安全柜中进行
- 使用过的材料须先高压灭菌（121°C，20 min）再废弃
- 用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 6888-1:2022 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium》。
该方法的原理是什么？
方法是将样品表面涂布于加有蛋黄乳液和亚碲酸钾的选择性 Baird-Parker 培养基上。亚碲酸钾（K₂TeO₃）被葡萄球菌还原为金属碲，使菌落呈特征性黑色。
测量范围和准确度是多少？
培养温度：34–38°C（最佳 37°C）；培养时间：24 ± 2 h（初读）+ 48 ± 4 h（终读）；培养基：Baird-Parker 琼脂 + 含亚碲酸钾的蛋黄乳液；菌落特征：黑色/灰色、有光泽、凸起，周围有透明圈。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 2 天 1 小时 20 分钟–3 天 1 小时 20 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
37°C 实验室培养箱、II 级生物安全柜、拍击式均质器、47–50°C 水浴、实验室高压灭菌器、涂布棒（L 棒）、0,1–1 mL 移液器。核心仪器的参考价格（37°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
奶酪和乳制品质量控制；即食（RTE）食品检验 — （EC）2073/2005 号法规标准；糕点房和餐饮企业生产卫生监测；婴幼儿食品控制；肉类及肉制品检验；人员手部和工作台面涂抹样检验（GHP）；流行病学调查中的食品分析（食物中毒）；热处理和保藏工艺有效性验证。
需要采取哪些安全防护措施？
金黄色葡萄球菌 — BSL-2 病原菌，须使用全套个人防护装备；亚碲酸钾 — 有毒，避免吸入和皮肤接触，在生物安全柜中操作；所有敞开样品的操作均须在 II 级生物安全柜中进行；使用过的材料须先高压灭菌（121°C，20 min）再废弃；用 70% 乙醇或 0,5% 次氯酸钠对台面消毒。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 6888-1。