🍎 用基于核酸的方法定性检测食品（也包括饲料和植物样品）中的转基因生物（GMO）及其衍生产品——按 ISO 21571 提取的 DNA 用 PCR 扩增（凝胶电泳或实时 PCR 检测，杂交、限制性酶切或测序确证），目标为分类单元特异性、筛选（例如 35S 启动子）、构建体特异性或转化事件特异性序列；采用 ISO 24276 的对照和判据，引物优化（18–30 个核苷酸，约 60 °C），高度降解的 DNA 采用 60–150 bp 扩增子；结果为“检出/未检出目标序列”，并给出检出限和标准物质，PN-EN ISO 21569

食品化学 PN-EN ISO 21569

概述

本标准涵盖的内容。标准正文我们读的是 iTeh 的 ISO 21569:2005 法文版样本（“Produits alimentaires — Méthodes d’analyse pour la détection des organismes génétiquement modifiés et des produits dérivés — Méthodes qualitatives basées sur l’utilisation des acides nucléiques”，第一版，15.06.2005，法文版 2006 年）：目录、前言、引言、第 1–10 章以及附录 A 开头至 A.1.5.3（大豆特异性方法）——样本止于第 9 页。欧洲前言我们读的是 SIST EN ISO 21569:2005 样本（英文文本，至 7.6）。附录 A 其余部分以及附录 B（筛选方法）、C（构建体特异性方法）和 D（转化事件特异性方法）我们未读；其标题来自目录。修订单 ISO 21569:2005/Amd 1:2013 我们读的是单独的 iTeh 样本（法文文本，“Amendement 1”，2013-04-01）：从封面至 A.6.3.3（第 11 页）；新条款 A.6 其余部分我们未读。

根据 ISO 21569:2005 的文本。本标准由 CEN/TC 275“食品分析——横向方法”与 ISO/TC 34 合作制定（维也纳协议）；据 EN 前言，各国标准最迟须在 2005 年 12 月采用。引言：转基因成分检测包括采样（ISO 21568）、核酸提取（ISO 21571）、可能的纯化、定量、稀释和分析（例如 PCR）；定量方法——ISO 21570，一般要求和定义——ISO 24276；定性检测在方法检出限和分析部分范围内，借助适当对照确定目标序列是否存在；附录 A–D 的方法从筛选到构建体特异性和转化事件特异性方法；符合本标准可能需要 PCR 技术许可。范围（1）：在从样品中提取的核酸中定性检测转基因生物及其衍生产品，主要采用 PCR 扩增；规定特异性检测和鉴定目标序列以及确认产品身份的要求；为食品基质制定，也可用于其他基质（例如饲料和环境中的植物样品）。引用文件（2）：ISO 21571:2005（提取）、ISO 24276（一般要求和定义，发布时尚在制定中）。原理（4）：每种方法须规定目标序列；定性结果须在检出限和试样范围内明确说明遗传元件是否存在；在确认无抑制物后，用 DNA 聚合酶和引物进行变性–退火–延伸循环扩增；用凝胶电泳或其他技术检测，用限制性内切酶、杂交或测序等确认身份；实时 PCR 中扩增与检测同时进行。试剂（5）：溶液通常保存于约 −20 °C，分装以避免冻融循环和污染；dNTP（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 或 dUTP——dUTP 可能影响限制性酶切分析）；PCR 缓冲液，MgCl2 浓度因方法而异（见附录）；热稳定聚合酶；引物。步骤（7）：DNA 须足够纯，其质量和数量对方法和基质具有重复性和再现性；检出限取决于产品加工和 DNA 降解；抑制对照一律按 ISO 24276；对每对引物优化条件（MgCl2、温度程序）；最佳反应中少于 40 个循环即可扩增 10 个目标分子，优化的 PCR 在 40 个循环内应能从 100 个拷贝的模板 DNA 得到可检测产物；建议采用热启动 PCR；验证数据可能不适用于其他基质和浓度；产物长度应与提取物中的 DNA 相适应——加工食品中高度降解的 DNA 为 60–150 bp，原料可达约 250 bp；引物 18–30 个核苷酸，最佳退火温度约 60 °C，由实验确定（估计解链温度——65 °C，其关系符号在样本文本中无法辨认），GC:AT 尽量接近 50:50，3′ 端互补性和二级结构尽量小；对特异性进行理论验证（数据库检索，例如 EMBL、GenBank）和实验验证；目标：分类单元特异性、构建体特异性、转化事件特异性序列和筛选元件；对照为强制性（ISO 24276），尽可能以有证标准物质作阳性和阴性对照；用针对另一序列的引物（尤其在筛选之后）或杂交、酶切、测序确认结果；对于来自天然生物（病毒、细菌）的序列，须核实 DNA 是否来自转基因生物——例如 35S 启动子来自花椰菜花叶病毒（CaMV），检出它可能意味着转基因生物，也可能只是 CaMV 本身。结果判读（8）：阳性——检出特异性产物且对照符合 ISO 24276 表 2；阴性——对照合格而未检出产物；转化事件特异性序列可能同时存在于一个转基因生物中（叠加性状）；结果不明确——重复检测。结果表示（9）：不用“±”；阴性结果绝不写成“不含转基因”；检出限须至少关联一种标准物质和该基质中的相对值（例如 0,01 % 时 100 ng GTS 40-3-2 DNA）；阴性结果：“样品 X 中未检出目标序列 Y。方法的 LOD 为 x %，用 ABC 测定”，若不能证明目标 DNA 量足以达到 LOD——另加说明该物种 DNA 量可能不足；阳性结果：“样品 X 中检出目标序列 Y”，适用时注明转基因生物身份；两个试样的结果须一致——不一致时重复，尽可能使用更多 DNA，并做抑制对照。试验报告（10）：按 ISO 24276，至少包括基质的 LOD、特异性描述和按第 9 章表示的结果。附录 A.1（大豆，凝集素基因 Le1，118 bp 扩增子，琼脂糖凝胶电泳）：方法经 BgVV 1997 年（25 家实验室，220 个接受结果，假阳性和假阴性均为 0）和 1998/1999 年（27 家实验室，60 个结果，假阳性和假阴性各 1 个——2 %）实验室间研究验证，按 ISO 21571:2005，A.3 用 CTAB 提取（试样 100 mg）；不扩增其他作物、牛肉和猪肉的 DNA；未测定绝对 LOD，至少可检出 0,1 ng 大豆 DNA。

根据修订单 ISO 21569:2005/AMD 1:2013。修订单由 ISO/TC 34“食品”第 SC 16 分委员会“分子生物标志物分析的横向方法”制定。引言：从步骤列表中删除采样（ISO 21568）。对 ISO 24276 的引用加注日期 2006（8.1 中亦同）。4.1 第 1 段——新表述：定性结果须明确指出所研究的遗传元件是否存在，并用适当对照检验；注：检出限和试样大小是方法的关键特性。7.3.3.3.3：针对分类单元特异性序列的引物须能在“适当”（原为“有代表性”）数量的该分类单元不同成员中可靠地检出这些序列。9.4——新表述：同一试样的结果须一致——两个平行出现 +/− 时重做两个 PCR，若新的平行仍为 +/− 或 −/−，该试样判为阴性；所有试样的结果须一致——至少一个试样阳性而另一个阴性时，重复分析；若从提取开始的整个程序至少有一次重复给出不明确结果，报告应说明样品在 LOD 水平为阴性。第 10 章：报告须说明方法的特异性（转化事件特异性、构建体特异性或筛选）。附录 A 新增 A.5——水稻特异性方法（蔗糖磷酸合酶基因 SPS，引物 SPS F/SPS R，279 bp 扩增子，常规 PCR 加电泳）：GMDL-SJTU 2007 年实验室间研究，12 家实验室；144 个水稻样品中 1 个假阴性（0,69 %），120 个其他植物样品中 2 个假阳性（1,67 %）；LOD 约为玉米粉中水稻质量分数 0,1 %（0,05 % 和 0,01 % 时仅部分实验室为阳性）；按 ISO 21571:2005，A.3 用 CTAB 提取；反应体系 30 µl，建议每个反应 100 ng DNA；35 个循环，退火 58 °C；20 g/l 琼脂糖凝胶含溴化乙锭 0,5 µg/ml，5 V/cm，20 min；DNA 溶液 4 °C 最多一周或 −20 °C 保存。新增 A.6——番茄特异性方法（LAT52 基因），针对种子、果实、番茄酱、果汁及其他产品优化：2007 年实验室间研究，13 家实验室；156 个中 1 个假阴性（0,64 %），130 个中 4 个假阳性（3,08 %），据原文可能源于 PCR 操作中的污染；实验室内研究中 LOD 至少为 0,1 %。

现行状态（截至 03.10.2026）。在 PKN 检索（关键词“21569”，03.10.2026）中 PN-EN ISO 21569:2007（波兰文版，“采用：EN ISO 21569:2005 [IDT]，ISO 21569:2005 [IDT]”）无撤销标注；另有补充件 PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07（英文版）。目录卡：发布日期 16.01.2007，71 页，KT 287 生物技术，ICS 67.050，“替代 PN-EN ISO 21569:2005（英文版）”，补充件 PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013-07E，无撤销标注。在 iTeh 目录中（读取于 03.10.2026）ISO 21569:2005 状态为“Published”，阶段 90.92（待修订的国际标准），自 29.08.2024 起；目录卡列出的修订文件为 ISO/TS 21569-10:2026，iTeh 检索还显示草案 prEN ISO 21569-1。

多少实验室、以何种形式（认可范围数据库副本，数据载入至 17.09.2026，读取于 03.10.2026）。编号 21569 出现在 3 家实验室的 3 条记录中：AB 465、AB 685、AB 868。在现行 PCA 文件中（读取于 03.10.2026；AB 465 第 31 版，23.12.2025；AB 685 第 19 版，29.01.2026；AB 868 第 21 版，06.03.2026），该标准出现在同样 3 家实验室的 3 行中——AB 685 的那一行中该编号出现 8 次（标准、修订单 A1:2013 以及六份作业指导书 IN-01–IN-06，第 03 版，29.12.2024）；每份文件的页码标记数等于 PDF 页数，无重复；检索 03.10.2026 从 BIP 下载的全部 PCA 文件，未发现数据库副本以外的实验室。写法为不带年份的“PN-EN ISO 21569”并附程序 PBD-73.00.00（AB 465）、带作业指导书的“PN-EN ISO 21569:2007”和“PN-EN ISO 21569:2007/A1:2013”（AB 685）、与 PN-EN ISO 21570 并列的“PN-EN ISO 21569”（AB 868）。这些项目均未暂停。“实验室”标签页（关键词“PN-EN ISO 21569”）显示全部 3 家实验室——已于 03.10.2026 在 labcoda.pl 生产服务器上用标签页查询核实。

实验室检测什么（PCA 中的项目）。AB 465：饲料（灵活范围）——转基因修饰是否存在，实时 PCR / PCR；AB 685：饲料——转基因特异序列是否存在：ctp2–cp4 epsps、nptII、bar、pFMV、pat、P-35S、T-nos，实时 PCR；AB 868：农产品和动物饲料（灵活范围）——转基因修饰是否存在及含量，PCR、实时 PCR，与 PN-EN ISO 21570 并列。

容易得到表面正确结果的环节。关于阴性结果：不得写“不含转基因”——只能写“未检出目标序列 Y”并附 LOD 和标准物质，DNA 可能不足时还须加注（9.1、9.2）。关于筛选元件：35S 启动子及其他来自天然生物（CaMV）的元件可能来自感染而非转基因生物——须排除该生物其他 DNA 的存在（7.6）；AB 685 检测 P-35S。关于加工后的 DNA：降解会降低可检测性，扩增子应为 60–150 bp（7.1、7.3.2）。关于对照：没有抑制对照、对照不符合 ISO 24276 时，结果既非阳性也非阴性（7.1、8.1）；两个试样须给出一致结果（9.4）。关于基质：本标准为食品制定，饲料仅作为可能的应用提及（1）——三家实验室都检测饲料。关于结果不一致：按修订单 A1:2013，重复后仍为 +/− 的试样判为阴性，重复程序得到的不明确结果报告为 LOD 水平阴性（A1 修订后的 9.4）——未修订的文本要求两个试样一致并重复检测。关于版本：AB 685 采用修订单 A1:2013，AB 465 和 AB 868 引用不带年份的标准。

我们不提供的内容。附录 B–D 的方法（筛选、构建体特异性和转化事件特异性）及大豆方法的其余部分我们不引用——它们在样本之外。修订单 A1:2013 中条款 A.6 的其余部分以及 ISO 24276 的内容我们未读。我们不提供法规中的转基因标识阈值。

方法原理

从样品中提取的 DNA（ISO 21571）用针对目标序列——分类单元特异性、筛选元件、构建体特异性或转化事件特异性——的一对引物进行 PCR 扩增，经历变性、引物退火和延伸循环。产物用凝胶电泳或实时 PCR 荧光检测，并用杂交、限制性酶切或测序确认。在对照符合 ISO 24276 的前提下，结果表述为“检出目标序列”或“未检出”，检出限关联到标准物质。

应用领域

• 食品中转基因生物及其衍生产品的定性检测；可能用于饲料和环境中的植物样品（1）
• 分类单元特异性（例如大豆凝集素）、筛选、构建体特异性和转化事件特异性方法（附录 A–D）
• 饲料和农产品——PCA 中 3 家实验室认可范围内的项目（PCR、实时 PCR）

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 21569:2007

标准名称（波兰语）

Artykuły żywnościowe — Metody wykrywania organizmów zmodyfikowanych genetycznie i produktów pochodnych — Metody jakościowe oparte na kwasach nukleinowych

标准名称（英语）

Foodstuffs — Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products — Qualitative nucleic acid based methods

分步操作程序

1. DNA 提取

   按 ISO 21571；纯度、数量重复性、抑制对照（7.1）。PN-EN ISO 21569:2007 在 PKN 中无撤销标注（03.10.2026）。

2. 选择目标和引物

   分类单元、筛选元件、构建体或转化事件；扩增子与 DNA 降解程度相适应（7.3、7.4）。

3. 带对照的 PCR

   优化 MgCl2 和温度程序，按 ISO 24276 设对照，使用标准物质（7.2、7.5）。

4. 检测和确认

   电泳或实时 PCR；用杂交、酶切或测序确认；检出 35S 时排除 CaMV（7.6）。

5. 结果

   对照合格时判为阳性或阴性；表述附 LOD；两个试样一致（8、9）。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 操作 DNA 和 PCR 试剂——防止交叉污染（分装、分区操作）
• 电泳——DNA 染料和紫外辐射按安全数据表处理

常见问题