🦠 水中的隐孢子虫与贾第虫——胶囊过滤、免疫磁分离与免疫荧光显微镜法
三句话速览
把大体积的水（10—1000 l）在过滤胶囊上浓缩，用洗脱缓冲液冲洗滤器并离心（1100 × g，15 min）；从沉淀中以免疫磁分离法分离出卵囊和包囊，用 FITC 标记的单克隆抗体和核染料 DAPI 染色，并在带 DIC 相衬的落射荧光显微镜下以 1000 倍放大计数。该检测依据 ISO 15553:2006；所测形态：隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊（不鉴定到种，不评价活力）。整个程序共 10 个步骤（合计约 20–20 分钟）；主要用于：取自地表和混合水源的饮用水的监测（这是《法律公报》2026 年第 748 项强制范围之外的检验）、处理效能的评价——针对耐氯存活形态的屏障、自来水厂取水的地表水与地下水的检验。
要点速览
- 标准: ISO 15553:2006
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 20 分钟–20 分钟
- 所测形态: 隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊（不鉴定到种，不评价活力）
- 样品体积: 10—1000 l；体积较小时（10—100 l）为瞬时样，1000 l 时在采样点现场过滤
- 完成检验的时限: 最好在采样后 24 h 内，不超过 4 天；在 (5 ± 3) °C 下保存
概述
隐孢子虫和贾第虫是引起人类肠道疾病的寄生原虫。这两种存活形态——卵囊和包囊——在水环境中能长期存活，而隐孢子虫的卵囊对饮用水和泳池水处理所用浓度的氯具有抗性。正因如此，如标准的引言所述，缺少粪便污染的营养型指示菌并不能证明这些原虫不存在——大肠埃希氏菌或肠球菌的检验结果对它们毫无说明力。
ISO 15553:2006 描述在地表水与地下水、经处理的水、矿泉水以及泳池水和娱乐用水中检出并计数隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的方法。本方法不能鉴定到种，不能确定它们来自哪种宿主，也不能评价所发现形态的活力或感染性；标准还保留规定，该检验只能由通过能力测试的有经验分析人员进行，并须定期以加标样品和能力验证加以核查。制片中可能出现在形态上与卵囊和包囊相似的物体——遇有疑问或结果异常偏高时，标准建议把制片送交另一实验室的专家评判。
该标准未被采用进波兰标准集合——PKN 目录中没有它的国家采用文本，而波兰的方法学工作（NIZP–PZH）直接援引 ISO 15553:2006。现行的卫生部长 2026 年 5 月 22 日关于供人饮用水质量的条例（《法律公报》2026 年第 748 项）既没有在水的参数中，也没有在指明了参照方法的微生物参数中列出隐孢子虫或贾第虫；因此这项检验是在强制范围之外进行的，用于风险评估和流行病学调查。此前的法律状态见 NIZP–PZH 2012 年的一篇工作：当时有效的条例规定，若在经处理的水中检出产气荚膜梭菌，则须对取自地表或混合水源的水进行隐孢子虫属的检验，而——如作者所指出的——这类检验在波兰的例行监测中并未开展。2006 年的第一版仍然有效：ISO 在 2021 年 3 月 22 日的系统复审中确认了它，而始于 2026 年 1 月 15 日的下一次复审已于 2026 年 6 月 5 日结束——其结论尚未记入生命周期卡片。没有指明替代标准。与此同时，生命周期卡片把该标准列在 90.92 阶段，即「待修订」——与本批次的 ISO 16200-1 一样：该标准仍然是现行版本，但 ISO 已把它交付修订，因此在程序文件中援引它时，值得核查是否已有新版本出现。在 NIZP–PZH 按本标准设定所做的地表水源（维斯瓦河、泽格热水库）研究中，全部样品都检出贾第虫包囊（每 10 l 为 1.0—38.9 个），近一半样品检出隐孢子虫卵囊（每 10 l 为 0.5—2.5 个）。
本条目中的波兰文标题是我们的工作译名，而不是官方标题：该标准未被采用进波兰标准集合。
方法原理
从水中分离原虫需要在保留卵囊和包囊的同时减小样品的体积。标准描述了两个先后进行的浓缩步骤：带洗脱的胶囊过滤，随后是低速离心。从浓缩后的固体颗粒悬浮液中，用免疫磁分离法（IMS）分离出卵囊和包囊：它们与包被了特异性抗体的顺磁性微球结合，用磁铁把微球与不需要的物质分开，随后用酸把卵囊和包囊从微球上解离下来并用碱中和。把分离出的生物体用与荧光素（通常为异硫氰酸荧光素，FITC）偶联的单克隆抗体标记，核物质则用核酸染料标记；制片在带微分干涉相衬（DIC）的落射荧光显微镜下观察。
应用领域
- 取自地表和混合水源的饮用水的监测（这是《法律公报》2026 年第 748 项强制范围之外的检验）
- 处理效能的评价——针对耐氯存活形态的屏障
- 自来水厂取水的地表水与地下水的检验
- 泳池水和娱乐用水（标准在适用范围中明确列出）
- 矿泉水和在管网中输配的经处理的水
- 怀疑发生水源性疾病暴发时的流行病学调查
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 所测形态 | 隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊（不鉴定到种，不评价活力） |
| 样品体积 | 10—1000 l；体积较小时（10—100 l）为瞬时样，1000 l 时在采样点现场过滤 |
| 完成检验的时限 | 最好在采样后 24 h 内，不超过 4 天；在 (5 ± 3) °C 下保存 |
| 洗脱液的离心 | 1100 × g 离心 15 min，减速阶段不制动 |
| 显微镜 | 总放大倍数 1000×，UV 滤光片（激发 350 nm / 发射 450 nm），FITC 滤光片（激发 480 nm / 发射 520 nm），DIC 光学系统 |
| 回收率（NIZP–PZH 数据，Filta-Max xpress 工作站，9 个冲洗循环） | 隐孢子虫卵囊平均 60.6 %，贾第虫包囊平均 36.1 % |
标准
- 标准编号
- ISO 15553:2006
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Izolowanie i identyfikacja oocyst Cryptosporidium i cyst Giardia z wody
- 标准名称（英语）
- Water quality — Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water
分步操作程序
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样品的采取
体积按水的种类和所需灵敏度选择：10—100 l 作为运回实验室的瞬时样，或在采样点现场过滤至多 1000 l。大体积时按制造商指明的流向把胶囊接入管路，并在采样前后读取流量计；不得超过推荐的流量。过滤 1000 l 可能需要长达 24 h。
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运输与保存
瞬时样和滤器应避光，在环境温度下运输。若不立即开始检验，在实验室中于 (5 ± 3) °C 保存。已冷藏的滤器在开始洗脱前应回到室温。
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滤器的洗脱
把 Envirochek STD 胶囊竖直放置、排气阀朝上，取下两端的封盖，把样品中残留的水经滤器排出。装上下端封盖，用洗脱缓冲液充填胶囊，使其没过滤器约 1 cm，封好并以 600 ± 25 次/min 水平振荡。第一次振荡后把洗液倒入 250 ml 锥形离心管，再加入一份缓冲液并再次振荡，同时改变排气阀的位置。
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离心与沉淀体积的测量
把合并的洗液以 1100 × g 离心 15 min，减速阶段不制动。离心后立即读取沉淀体积。若超过 IMS 试剂盒制造商推荐的数值，把样品分为若干份。
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吸去上清并调平体积
在低于 20 kPa 的负压下用吸管吸去上清，在沉淀上方留下 2—5 ml；沉淀不可见时须格外小心。用去离子水补至 9 ml 并涡旋 10—15 s。该悬浮液可在 (5 ± 3) °C 下保存至进行 IMS。
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免疫磁分离（IMS）
把卵囊和包囊与包被了特异性抗体的顺磁性微球结合，用磁铁把微球与其余物质分开，随后在免疫染色前用酸把生物体从微球上解离并用碱中和。
-
制片的染色
把分离出的生物体用与荧光素（通常为 FITC）偶联的单克隆抗体标记，核物质用核酸染料（DAPI）标记。制片在湿盒中孵育，用免疫荧光封片介质封片。
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显微镜检查
在落射荧光显微镜下以总放大倍数 1000×、配 FITC 滤光片（激发 480 nm、发射 520 nm）和 UV 滤光片（350/450 nm）并在 DIC 相衬下通检制片。形态上与卵囊和包囊相似的结构可能给出假阳性结果——遇有疑问或结果异常偏高时，把制片送交另一实验室的专家评判。
-
质量控制与回收率
标准另行规定了质量控制程序（第 8 章）以及阳性对照的制备和回收率试验（附录 D）。在 NIZP–PZH 的实践中，用称量的标准悬浮液（99 ± 1.4 个卵囊和 99 ± 1.6 个包囊）对体积 20 l 的自来水样品加标，并据此计算回收率。
-
结果的给出
结果以受检水体积中隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的数目给出（波兰的工作中通常按每 10 l 计）。检测报告中应记明所过滤水的体积和所用的过滤系统，因为测定的灵敏度取决于它们。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 用于浓缩样品的过滤胶囊 | Pall Envirochek STD（10—200 l）、Pall Envirochek HV（10—1000 l）或 IDEXX Filta-Max（10—1000 l）——标准在表 1 中列出这三种系统 | — |
| 蠕动泵 | 流量 2 l/min（Envirochek）或 4 l/min（Filta-Max），配硅胶管 | — |
| 腕动式振荡器 | 带用于固定 Envirochek 胶囊的臂，工作频率 600 ± 25 次/min | — |
| 实验室离心机 | 加速度至少 1100 × g，250 ml 和 50 ml 带旋盖的锥形离心管 | — |
| 免疫磁分离用磁性颗粒浓缩架 | 与 IMS 试剂盒配套的磁力架和离心管 | — |
| 带 DIC 光学系统的落射荧光显微镜 | UV 滤光片 350/450 nm，FITC 滤光片 480/520 nm，带测量网格的目镜，放大 1000×；校准用 1 mm 物镜测微尺 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Envirochek 胶囊用洗脱缓冲液 | — | 按附录 A 用 pH 7.4 的 Tris 缓冲液、0.5 mol/l pH 8.0 的 EDTA 溶液、去污剂 Laureth 12 和消泡剂 Antifoam A 配制 |
| 含 Tween 20 的磷酸盐缓冲液（PBS） | — | Filta-Max 滤器用洗脱缓冲液——PBS 加聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯（Tween 20）；在室温 (20 ± 5) °C 下保存 |
| 免疫磁分离用磁珠 | — | 包被了抗隐孢子虫和抗贾第虫抗体的顺磁性微球；有效期由制造商给出 |
| 荧光标记的单克隆抗体 | — | 抗隐孢子虫和抗贾第虫，在 (5 ± 3) °C 下保存；由浓缩液配制的工作液在 (5 ± 3) °C 下不超过 6 个月 |
| DAPI——4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐二水合物 | — | 冻干试剂，由它配制储备液和工作液（A.3.2、A.3.3）；它使核物质着色，在 350 nm 紫外光下观察 |
| 微小隐孢子虫卵囊与蓝氏贾第虫包囊的标准悬浮液 | — | 在 (5 ± 3) °C 下保存，绝不可冷冻；最好不超过 3 个月，并经显微镜检查（结块时弃用） |
职业健康与安全
- 隐孢子虫和贾第虫对人具有致病性（肠道疾病）——样品、浓缩物和标准悬浮液应作为感染性物料对待
- 隐孢子虫卵囊对水处理所用浓度的氯具有抗性——用次氯酸盐消毒并不是处理该类物料后为器材消毒的可靠办法
- 标准悬浮液应在 (5 ± 3) °C 下保存且绝不可冷冻；结块或着色减弱的悬浮液不得使用
- 该检验只能由通过能力测试的分析人员进行，并须定期以加标样品和外部能力验证计划加以核查
- 用于固定制片的甲醇和溶剂——须在通风柜中作业，远离火源，佩戴手套和护目镜
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 ISO 15553:2006 — 《Water quality — Isolation and identification of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water》。
该方法的原理是什么？
从水中分离原虫需要在保留卵囊和包囊的同时减小样品的体积。标准描述了两个先后进行的浓缩步骤：带洗脱的胶囊过滤，随后是低速离心。
测量范围和准确度是多少？
所测形态：隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊（不鉴定到种，不评价活力）；样品体积：10—1000 l；体积较小时（10—100 l）为瞬时样，1000 l 时在采样点现场过滤；完成检验的时限：最好在采样后 24 h 内，不超过 4 天；在 (5 ± 3) °C 下保存；洗脱液的离心：1100 × g 离心 15 min，减速阶段不制动。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 20 分钟–20 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
用于浓缩样品的过滤胶囊、蠕动泵、腕动式振荡器、实验室离心机、免疫磁分离用磁性颗粒浓缩架、带 DIC 光学系统的落射荧光显微镜。
该检测用于哪些场景？
取自地表和混合水源的饮用水的监测（这是《法律公报》2026 年第 748 项强制范围之外的检验）；处理效能的评价——针对耐氯存活形态的屏障；自来水厂取水的地表水与地下水的检验；泳池水和娱乐用水（标准在适用范围中明确列出）；矿泉水和在管网中输配的经处理的水；怀疑发生水源性疾病暴发时的流行病学调查。
需要采取哪些安全防护措施？
隐孢子虫和贾第虫对人具有致病性（肠道疾病）——样品、浓缩物和标准悬浮液应作为感染性物料对待；隐孢子虫卵囊对水处理所用浓度的氯具有抗性——用次氯酸盐消毒并不是处理该类物料后为器材消毒的可靠办法；标准悬浮液应在 (5 ± 3) °C 下保存且绝不可冷冻；结块或着色减弱的悬浮液不得使用；该检验只能由通过能力测试的分析人员进行，并须定期以加标样品和外部能力验证计划加以核查；用于固定制片的甲醇和溶剂——须在通风柜中作业，远离火源，佩戴手套和护目镜。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 ISO 15553。