🦠 化妆品中的Escherichia coli（大肠埃希氏菌）——在Eugon LT 100肉汤中增菌并在麦康凯琼脂上分离的检出法
三句话速览
把化妆品样品（≥ 1 g或1 ml）在含中和剂的非选择性Eugon LT 100肉汤中增菌，随后在选择性麦康凯琼脂上分离E。该检测依据 PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022)；样品：用于初始悬液的至少1 g或1 ml产品。整个程序共 6 个步骤；主要用于：化妆品微生物洁净度的控制——检出作为规定微生物的E. coli（水基产品：乳霜、润肤乳、凝胶）、化妆品批次的放行和原料的检验、微生物稳定性和防腐效能的检验（与PN-EN ISO 21149、16212、22717、22718、18416配套）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 样品: 用于初始悬液的至少1 g或1 ml产品
- 步骤: 在非选择性肉汤中增菌 → 在选择性琼脂上分离 → 鉴定
- 增菌培养基: Eugon LT 100肉汤（或标准规定的其他增菌肉汤）
概述
ISO 21150:2015给出了检出和鉴定Escherichia coli的一般指南——它是化妆品中的“规定”微生物；规定微生物的清单可能因各国的惯例和法规而异。该方法基于在非选择性液体培养基（增菌肉汤）中检出E. coli，随后在选择性琼脂培养基上分离；视所要求的检出水平而定，其他方法也可能是适宜的（如转接到非选择性培养基并用试剂盒鉴定）。由于化妆品种类繁多，该方法未必在每一细节上都适合某些产品（如与水不混溶的产品）——此时ISO 18415可能是适宜的；替代方法（如自动化方法）在证明等效后可以使用。该标准建议进行微生物风险分析，以确定该方法适用于哪些产品；低风险产品（ISO 29621）包括水分活度低的、含水醇的和pH极端的产品。
在波兰它以PN-EN ISO 21150:2016-01连同A1:2023-03修改单施行（取代了PN-EN ISO 21150:2010）。在检验化妆品微生物洁净度的实验室实践中，该标准属于用于定量和定性检验的PN-EN ISO系列（21149、16212、22718、22717、18416）；为核实E. coli的存在，要在选择性－鉴别性的麦康凯培养基上接种，该菌在其上形成带深粉色边缘的深粉色菌落。
方法原理
第一步是在非选择性肉汤中增菌，它使微生物数量增加而不会被选择性－鉴别性培养基中的选择性成分抑制；第二步（分离）在选择性培养基上进行，随后做鉴定试验。样品对微生物生长可能存在的抑制必须被中和，才能检出活细胞——在任何情况下、无论采用何种方法，都必须检查并证明产品抗菌性能已被中和（标准第11章，在大豆酪蛋白琼脂上的适用性试验）。样品为用以配制初始悬液的至少1 g或1 ml产品。标准列出的培养基有：作为菌悬液稀释液的胰蛋白胨氯化钠溶液、用于适用性试验的大豆酪蛋白琼脂、用于增菌的Eugon LT 100肉汤（也允许使用其他增菌肉汤）、用于分离E. coli的麦康凯琼脂（其中每升含中性红30.0 mg和结晶紫1.0 mg；溶解后煮沸1 min并在121 °C下灭菌15 min），以及用于确证的Levine氏伊红亚甲蓝琼脂（EMB）（每升含伊红Y 400 mg和亚甲蓝65 mg；每100 ml熔化的琼脂中加入20 %乳糖溶液5 ml、2 %伊红Y 2 ml和0.033 %亚甲蓝2 ml；在121 °C下灭菌15 min）。所有培养基均在高压灭菌器中于121 °C灭菌15 min。
应用领域
- 化妆品微生物洁净度的控制——检出作为规定微生物的E. coli（水基产品：乳霜、润肤乳、凝胶）
- 化妆品批次的放行和原料的检验
- 微生物稳定性和防腐效能的检验（与PN-EN ISO 21149、16212、22717、22718、18416配套）
- 化妆品行业的合同实验室和企业实验室；经风险分析后的低风险产品（ISO 29621）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 样品 | 用于初始悬液的至少1 g或1 ml产品 |
| 步骤 | 在非选择性肉汤中增菌 → 在选择性琼脂上分离 → 鉴定 |
| 增菌培养基 | Eugon LT 100肉汤（或标准规定的其他增菌肉汤） |
| 分离培养基 | 麦康凯琼脂（中性红30 mg/l，结晶紫1 mg/l）；菌落为带边缘的深粉色 |
| 确证培养基 | Levine氏EMB琼脂（伊红Y 400 mg/l，亚甲蓝65 mg/l，乳糖） |
| 有效性条件 | 已证明产品抗菌性能被中和（第11章） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022)
- 标准名称（波兰语）
- Kosmetyki — Mikrobiologia — Wykrywanie obecności Escherichia coli
- 标准名称（英语）
- Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli
分步操作程序
-
风险分析与样品制备
确定产品是否需要检验（微生物风险分析，ISO 29621）。取至少1 g或1 ml产品，在含中和剂的增菌肉汤中配制初始悬液。
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适用性试验（中和）
证明产品的抗菌性能已被中和（标准第11章）——使用参比菌株在胰蛋白胨氯化钠溶液中的悬液和大豆酪蛋白琼脂。
-
增菌
把初始悬液在非选择性Eugon LT 100肉汤（或标准允许的其他增菌肉汤）中，按标准给出的条件培养。
-
分离
从增菌培养物接种麦康凯琼脂并培养；寻找E. coli的特征性菌落（带深粉色边缘的深粉色菌落）。
-
确证与鉴定
把可疑菌落转接到Levine氏EMB琼脂上并做鉴定试验（如转接到非选择性培养基后用鉴定试剂盒）。
-
结果
报出受检产品样品（1 g或1 ml）中E. coli的存在或不存在，并说明已证明的中和情况。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 高压灭菌器121 °C | 培养基灭菌15 min | — |
| 用于培养的培养箱 | 条件按标准操作步骤各章的规定 | — |
| 水浴／电热板 | 灭菌前把麦康凯琼脂煮沸1 min | — |
| 培养皿、试管、无菌移液管 | 微生物实验室的标准装备 | — |
| 鉴定试剂盒 | E. coli分离株的鉴定（按标准——鉴定试验） | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 胰蛋白胨氯化钠溶液 | — | 菌悬液的稀释液（参比菌株、适用性试验） |
| 大豆酪蛋白琼脂 | — | 方法适用性试验（中和，第11章） |
| Eugon LT 100肉汤 | — | 带防腐剂中和的非选择性增菌 |
| 麦康凯琼脂 | — | E. coli的选择性分离 |
| 含乳糖的Levine氏伊红亚甲蓝琼脂（EMB） | — | E. coli的确证 |
职业健康与安全
- E. coli可能包括致病菌株——在微生物实验室条件下操作，对培养物高压灭菌
- 培养基中的染料（结晶紫、伊红、亚甲蓝）——避免接触皮肤，戴手套
- 煮沸和高压灭菌后的高温培养基——有烫伤风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 21150:2016-01 + A1:2023-03 (ISO 21150:2015 + Amd 1:2022) — 《Cosmetics — Microbiology — Detection of Escherichia coli》。
该方法的原理是什么？
第一步是在非选择性肉汤中增菌，它使微生物数量增加而不会被选择性－鉴别性培养基中的选择性成分抑制；第二步（分离）在选择性培养基上进行，随后做鉴定试验。样品对微生物生长可能存在的抑制必须被中和，才能检出活细胞——在任何情况下、无论采用何种方法，都必须检查并证明产品抗菌性能已被中和（标准第11章，在大豆酪蛋白琼脂上的适用性试验）。
测量范围和准确度是多少？
样品：用于初始悬液的至少1 g或1 ml产品；步骤：在非选择性肉汤中增菌 → 在选择性琼脂上分离 → 鉴定；增菌培养基：Eugon LT 100肉汤（或标准规定的其他增菌肉汤）；分离培养基：麦康凯琼脂（中性红30 mg/l，结晶紫1 mg/l）；菌落为带边缘的深粉色。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
高压灭菌器121 °C、用于培养的培养箱、水浴／电热板、培养皿、试管、无菌移液管、鉴定试剂盒。
该检测用于哪些场景？
化妆品微生物洁净度的控制——检出作为规定微生物的E. coli（水基产品：乳霜、润肤乳、凝胶）；化妆品批次的放行和原料的检验；微生物稳定性和防腐效能的检验（与PN-EN ISO 21149、16212、22717、22718、18416配套）；化妆品行业的合同实验室和企业实验室；经风险分析后的低风险产品（ISO 29621）。
需要采取哪些安全防护措施？
E. coli可能包括致病菌株——在微生物实验室条件下操作，对培养物高压灭菌；培养基中的染料（结晶紫、伊红、亚甲蓝）——避免接触皮肤，戴手套；煮沸和高压灭菌后的高温培养基——有烫伤风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 21150。