🦠 食品中葡萄球菌肠毒素 SEA、SEB、SEC、SED 和 SEE 的筛查检测——25 g 样品加约 40 ml 38 °C 的水均质，振荡 30–60 min，酸化至 pH 3.5–4.0，离心（≥ 3130 g，15 min），中和至 pH 7.4–7.6，提取液在 PEG 溶液中透析浓缩至 5.0–5.5 g，用符合以下标准的商品化免疫酶试剂盒（如 ELFA、ELISA）检测毒素：灵敏度和特异性高于 90 %，LOD50 低于 0.06 ng/g；对乳和乳制品必须浓缩，PN-EN ISO 19020

微生物学 PN-EN ISO 19020

概述

本标准涵盖的内容。标准正文我们读的是 iTeh 的 ISO 19020:2017 样本（英文文本）：标题页、目录、前言、引言、第 1–8 章以及第 9 章（质量控制）开头——样本止于第 6 页。8.7“检测”在样本中不完整（只剩关于选择试剂盒和按制造商说明操作的两句话），第 2 章第一项部分缺失（ISO 3696，分析用水，由 5.1 得知）。第 10–13 章（结果表示、确认、方法性能特征、试验报告）和附录 A–C 我们未读；其标题来自目录。

根据 ISO 19020:2017 的文本。本文件由 CEN/TC 275“食品分析——横向方法”与 ISO/TC 34“食品”第 SC 9 分委员会“微生物学”合作制定（维也纳协议）。目录：8 操作（8.1 试样，8.2 样品储存，8.3 提取，8.4 提取液浓缩——乳和乳制品必须进行，8.5 浓缩提取液的回收，8.6 检测前储存，8.7 检测，8.8 性能标准），9 质量控制，10 结果表示，11 确认，12 方法性能特征，13 试验报告，附录 A 和 B（资料性）——2013 年和 2014 年实验室间研究结果，附录 C（资料性）“干扰说明”。引言：葡萄球菌肠毒素（SEs）是某些凝固酶阳性葡萄球菌菌株（主要是金黄色葡萄球菌）在食品中产生的蛋白质；耐热耐酸，摄入后引起恶心、呕吐、腹痛和腹泻；由于其稳定性，即使检测不到葡萄球菌也可能存在；它们是 20 多种分子量 19–30 kDa 的蛋白质家族，耐热处理、冷冻、pH 变化和蛋白水解；纳克级的量即可引起中毒；欧盟已制定微生物标准，包括凝固酶阳性葡萄球菌计数和 SEs 检测。液相色谱–串联质谱方法尚在开发中，因此选择使用商品化试剂盒的酶免疫测定（EIA）方法作为标准化的起点；试剂盒性能标准已在五类食品基质上评估；可接受的 LOD50 由按美国 EPA 方法根据中毒事件数据（包括欧盟凝固酶阳性葡萄球菌参考实验室的数据）建立的基准剂量（BMD）得出。范围（1）：食品中肠毒素 SEA、SEB、SEC、SED 和 SEE 检测的筛查方法，分两步：基于透析的提取浓缩和用商品化试剂盒的免疫酶检测；适用于供人类消费的产品；其他肠毒素（SEG、SEH、SEI、SER、SES、SET）也可致病，但由于缺乏试剂盒，本标准仅涵盖 SEA–SEE，经验证后可用于其他类型。引用文件（2）：ISO 3696（分析用水）、ISO 7218（微生物检验一般要求）。定义（3）：SEA–SEE——产肠毒素菌株分泌的分子量 19–30 kDa 的胞外蛋白；特异性（SP）——阴性结果数除以检测的空白样品数；灵敏度（SE）——阳性结果数除以在给定污染水平下检测的样品数；LOD50——检出概率为 50 % 的浓度（ng SE/g）；BMD——可能使一定比例暴露人群出现症状的危害剂量。试剂（5）：符合 ISO 3696 的水；盐酸和氢氧化钠（如 5N、1N）；PBS pH 7.3 ± 0.2（NaCl/Na2HPO4 145/10 mM）；分子量 20 000 g/mol 的 PEG 溶液（30 g 粉末加 70 ml 水）；电极清洗液（如 70 % 乙醇）；符合 8.8 标准的 SE 免疫酶试剂盒。仪器（6）：符合 ISO 7218 的微生物设备；搅拌机；天平；均质器——强烈推荐旋转均质器，使用拍打式均质器时只能用无滤网袋；振荡器；pH 计；≥ 3130 g 离心机，最好可冷冻；截留分子量 6000–8000 Da 的透析膜及夹子；过滤材料；浅盘；冰箱 (3 ± 2) °C 或 (5 ± 3) °C 和冷冻箱 ≤ −18 °C；为避免毒素吸附用玻璃或聚丙烯器皿；水浴 (38 ± 2) °C。取样（7）：不属于本方法。试样（8.1）：带皮奶酪取约 10 % 外皮和 90 % 内部；毒素可能分布不均，因此将整个样品或其代表性部分均质后取 25 g；疑似食物中毒时试样量可以较少，试样质量与浓缩提取液质量之比约为 5（25 g 对应 5.0–5.5 g 提取液，黏稠提取液最多 5.8 g）。储存（8.2）：建议在 (3 ± 2) °C 或 (5 ± 3) °C 储存；24 h 内不能分析时冷冻，在冰箱中完全解冻，避免反复冻融。提取（8.3）：25 g 样品加约 40 ml 38 °C 的水（液体产品不加水），均质（对高脂产品尤其重要）；在 18–27 °C 振荡 30–60 min；用 HCl 酸化至 pH 3.5–4.0；在约 4 °C 或室温下 ≥ 3130 g 离心 15 min（高脂样品推荐冷冻离心）；离心后 pH 须为 3.0–4.5——高于 4.5 再次酸化，低于 3.0 时 SE 结构可能受损，须重新取样；用 NaOH 中和至 pH 7.4–7.6——高于 9.0 须重新取样；再次离心并回收全部水相。不经透析的替代程序（8.3.10）：仅在有限情况下使用，如疑似食物中毒事件，且不得用于乳和乳制品——结果阴性时须当日浓缩剩余水相并重复检测。浓缩（8.4）：透析膜经复水和冲洗，通过带过滤材料的漏斗装入全部中和水相，平放在盛有 PEG 溶液的浅盘中，在冰箱中过夜；若膜内剩余超过 5 ml——延长时间（最多 3 天）或在膜上撒加 PEG 粉末。回收（8.5）：冲去膜外 PEG，用 PBS（乳和乳制品）或水（其他基质）冲洗回收提取液，揉搓内壁，使每 25 g 试样的提取液质量为 5.0–5.5 g（5.8 g）。提取液储存（8.6）：冰箱中最多 48 h，更长时间在 ≤ −18 °C。检测（8.7，不完整）：使用对整个程序符合标准的试剂盒，按制造商说明操作。性能标准（8.8）：特异性和灵敏度高于 90 %，LOD50 低于 0.06 ng SE/g——基于 SEA 的 BMD 6.1 ng 和假定摄入 100 g 食品；由于缺乏其他类型的数据，此值也用于 SEB–SEE；不同试剂盒和基质（有无透析）的数值见第 12 章，实验室应据此选择试剂盒；实验室间研究的结果可能不适用于附录 A 和 B 以外的食品类型。质量控制（9，开头）：建议用标准物质检查整个程序。

状态（截至 03.10.2026）。在 PKN 搜索中（检索词“19020”，03.10.2026），唯一结果是 PN-EN ISO 19020:2017-08（英文版，“Wprowadza: EN ISO 19020:2017 [IDT], ISO 19020:2017 [IDT]”），没有废止标注。卡片：发布日期 23.08.2017，36 页，KT 3 Mikrobiologii Łańcucha Żywnościowego，ICS 07.100.30，没有废止标注。在 iTeh 目录中（03.10.2026 读取），ISO 19020:2017 状态为“Published”，阶段 90.93（国际标准已确认）。

多少实验室、以何种形式（认可范围数据库副本，数据截至 17.09.2026，03.10.2026 读取）。编号 19020 出现在 4 家实验室的 4 条记录中：AB 377、AB 485、AB 486、AB 598。在现行 PCA 文件中（03.10.2026 读取；AB 377 第 29 版 12.12.2025，AB 486 第 29 版 23.07.2026，AB 598 第 36 版 30.07.2026，AB 485 第 27 版 19.08.2026），该编号出现在同样 4 家实验室的 4 行中；各文件页码标记数等于 PDF 页数，无重复；对 03.10.2026 从 BIP 下载的全部 PCA 文件的检索未发现数据库副本之外的实验室。形式为“PN-EN ISO 19020:2017-08”（AB 485）、“PN-EN ISO 19020: 2017-08 z wył. pkt 11”（AB 377）、带 Vidas Staph Enterotoxin II（SET2）试剂盒说明书的“PN-EN ISO 19020 z wyłączeniem pkt. 11”（AB 598）以及“PN-EN ISO 19020”（AB 486）。这些项目均未暂停。“实验室”标签（检索词“PN-EN ISO 19020”）显示全部 4 家实验室——已于 03.10.2026 在 labcoda.pl 生产服务器上通过标签查询核实。

实验室检测什么（PCA 中的项目）。对象：生乳及生乳制品、热处理乳和乳制品、待烹饪的生肉和肉制品及禽肉制品、即食和待加热肉制品及其他类别（AB 377）；肉和肉制品、乳和乳制品、鱼和鱼制品、蛋和蛋制品、熟食（AB 485）；食品（AB 486、AB 598）。特性：葡萄球菌肠毒素的存在。技术：使用 mini VIDAS 仪器的酶联荧光分析（ELFA）（AB 377）、ELFA（AB 598）、使用 mini VIDAS 仪器的免疫酶法（AB 486）、ELFA 或 ELISA（AB 485）。

容易得到看似正确结果的地方。阴性结果：本标准仅检测 SEA–SEE，而其他肠毒素（SEG、SEH、SEI、SER、SES、SET）也可致病（1）——阴性结果不能排除这五种以外的毒素。试剂盒：结果取决于试剂盒，其对包括提取在内的整个程序必须满足 LOD50 < 0.06 ng/g 以及灵敏度和特异性 > 90 %（8.8）；第 12 章数据针对实验室间研究的基质。pH：酸化后低于 3.0 或中和后高于 9.0 时毒素结构可能受损，须重新取样（8.3.6、8.3.7）。乳：透析浓缩是必须的，不允许使用不经透析的程序（8.3.10、8.4）。器皿：玻璃或聚丙烯，因为毒素会吸附在其他材料上（6.12）。样品：反复冻融会导致毒素损失（8.2）。排除：AB 377 和 AB 598 排除第 11 条，按目录该条涉及确认——该条内容我们未读。

我们未提供的内容。结果表示、确认程序、各试剂盒和基质的性能数据、实验室间结果以及干扰说明（第 10–13 章、附录 A–C）未予引用——它们在样本之外。我们不提供法规中的微生物标准。

方法原理

从 25 g 样品（加约 40 ml 38 °C 的水）中振荡提取毒素，酸化至 pH 3.5–4.0，离心，中和至 pH 7.4–7.6 后再次离心。水相在浸于 PEG 20 000 溶液中的 6000–8000 Da 透析膜中浓缩，提取液回收至 5.0–5.5 g。用商品化免疫酶试剂盒检测肠毒素 SEA–SEE，该试剂盒对整个程序满足灵敏度和特异性 > 90 % 以及 LOD50 < 0.06 ng/g。

应用领域

• 筛查检测供人类消费产品中的葡萄球菌肠毒素 SEA、SEB、SEC、SED 和 SEE（1）
• 疑似食物中毒——较小试样和不经透析的程序，但不适用于乳和乳制品（8.1、8.3.10）
• 乳和乳制品、肉、禽、鱼、蛋、熟食、一般食品——PCA 中 4 家实验室认可范围内的项目

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 19020:2017-08

标准名称（波兰语）

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda immunoenzymatycznego wykrywania enterotoksyn gronkowcowych w żywności

标准名称（英语）

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the immunoenzymatic detection of staphylococcal enterotoxins in foodstuffs

分步操作程序

1. 试样

   25 g 均质样品（奶酪：10 % 外皮、90 % 内部）；冰箱储存，避免反复冷冻（8.1、8.2）。PN-EN ISO 19020:2017-08 在 PKN 中无废止标注（03.10.2026）。

2. 提取

   约 40 ml 38 °C 水，均质，振荡 30–60 min（8.3.1–8.3.3）。

3. pH 净化

   酸化至 pH 3.5–4.0，离心，检查 pH 3.0–4.5，中和至 7.4–7.6，离心（8.3.4–8.3.9）。

4. 浓缩

   在冰箱中于 PEG 中透析过夜；用 PBS 或水回收提取液至 5.0–5.5 g（8.4、8.5）。

5. 检测

   使用符合 8.8 标准的免疫酶试剂盒，按制造商说明操作（8.7、8.8）。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 葡萄球菌肠毒素——按 ISO 7218 在微生物实验室操作，避免产生气溶胶
• 5N 盐酸和氢氧化钠——腐蚀性，佩戴眼部和手部防护

常见问题