🦠 用微型化方法测定地表水、游泳水和废水中肠道肠球菌的最大可能数（MPN）——用含海盐的专用稀释液稀释样品，每孔200 µl加入含脱水MUD/SF培养基的96孔微孔板，44 °C ± 0,5 °C培养36–72 h，在366 nm紫外光下呈蓝色荧光的孔为阳性，结果以MPN/100 ml及95 %置信区间表示，PN-EN ISO 7899-1

微生物 PN-EN ISO 7899-1

概述

本标准内容。PKN目录卡片PN-EN ISO 7899-1:2002（波兰文版）的范围全文（我们对波兰文卡片的翻译）：“描述了检测地表水和废水中大多数肠道肠球菌的方法，以及通过测定其最大可能数——MPN对这些细菌进行计数的方法”。标准文本我们阅读的是ISO 7899-1:1998试读本：前言、引言和第4–10章（原理、仪器、取样、培养基、步骤、结果表示、试验报告）；试读本中含第1–3章（范围、规范性引用文件、定义）的页面为空白，附录A–G（MPN计算程序、表格、海盐成分、微孔板中培养基的质量判据——E、校准微孔板的制备——F）我们没有。

依据ISO 7899-1:1998文本（前言、引言、第4–10章）。本标准由ISO/TC 147“水质”SC 4分委员会“生物学方法”编制；第二版取代第一版（ISO 7899-1:1984）。ISO 7899系列：第1部分——液体培养基接种的微型化MPN法，第2部分——膜过滤法；附录E和F为规范性，A、B、C、D和G为资料性。引言：目的是测定主要的肠道肠球菌——粪肠球菌、屎肠球菌、耐久肠球菌和希氏肠球菌——常见于人和温血动物粪便；偶尔检出其他粪源种（鸟肠球菌、盲肠肠球菌、鸽肠球菌、鹑鸡肠球菌）和牛链球菌/马链球菌菌株，它们在环境样品中少见且回收率低；非粪源种铅黄肠球菌和蒙氏肠球菌（如来自植物材料和某些工业废水）也计为肠道肠球菌——它们在非选择性培养基上通常产生黄色色素——解释结果时须考虑这一点。原理（第4章）：将稀释样品接种到含脱水培养基的微孔板的一排孔中；44 °C ± 0,5 °C培养36–72 h后，在暗处于366 nm紫外光下观察平板；MUD（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷）水解产生的荧光表示存在肠球菌；结果以MPN/100 ml表示。仪器（第5章；玻璃器皿按ISO 8199灭菌）：干热灭菌器或高压灭菌器；44 °C ± 0,5 °C培养箱；隧道式干燥器或垂直层流柜（宜为II级）；紫外观察箱（伍德灯366 nm）——警告：紫外线刺激皮肤和眼睛，戴手套和护目镜；便携式折光仪（可选）；pH计±0,1；16 × 160 mm和20 × 200 mm试管；8通道多道移液器或其他每孔分配200 µl的系统及无菌吸头；带0,2 µm滤膜的膜过滤装置，用于培养基除菌；无菌96孔微孔板，350 µl，平底，无荧光；无菌封板胶带；无菌90 mm培养皿。取样（第6章）：按ISO 8199及ISO 5667-1、-2和-3。培养基和稀释液（第7章）：用质量均一的成分或现成脱水制品配制；蒸馏水或软化水，不含抑制或促进生长的物质；未立即使用的——在(5 ± 3) °C暗处保存，最长一个月。专用稀释液SD（7.2.1）：合成海盐22,5 g，可选10 ml溴酚蓝溶液（0,04 g溶于100 ml 50 %乙醇——仅用于着色以免与水混淆），加水至1000 ml；121 °C ± 3 °C高压灭菌15–20 min；纯NaCl溶液不适用（明显抑制）；海盐典型成分——附录C。MUD/SF培养基（7.3）：溶液A——胰蛋白胨40 g、KH2PO4 10 g、D(+)-半乳糖2 g、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯（吐温80）1,5 ml、水900 ml，加热溶解并煮沸；溶液B——NaHCO3 4 g、萘啶酸250 mg、水50 ml；溶液C——乙酸铊(I) 2 g、2,3,5-氯化三苯基四氮唑0,1 g、水50 ml；溶液D——MUD 150 mg溶于2 ml N,N-二甲基甲酰胺；警告：乙酸铊和N,N-二甲基甲酰胺有毒——在通风橱中操作；配制：混合A + B + C + D，pH 7,5 ± 0,2，0,2 µm过滤除菌，每孔分装100 µl（孔容量至少350 µl），立即在隧道式干燥器或层流柜中脱水；培养基生产须满足附录E的质量判据。稀释方案选择（8.1，表1，从第4页图像读取）：游泳水——2个稀释度：64孔1/2和32孔1/20，测量范围15至3,5 × 10⁴个细菌/100 ml；其他地表水——4个稀释度各24孔（1/2、1/20、1/200、1/2000），40至3,2 × 10⁶/100 ml；废水和污水处理厂——6个稀释度：16孔1/2至16孔1/200 000，60至6,7 × 10⁸/100 ml。稀释（8.2；宜在生物安全柜中进行——气溶胶）：淡水和微咸水（盐度< 30 g/kg，用折光仪测）——每管加9 ml SD稀释液，第一管加9 ml混匀样品（1/2），第二管加1 ml（1/20），之后按1/10递减；海水（盐度> 30 g/kg）——第一管用9 ml蒸馏水或软化水代替SD，后续用SD。接种（8.3.1）：将试管内容物倒入无菌培养皿（至少90 mm），用8通道移液器每孔200 µl分配到该稀释度对应的孔中，每个稀释度更换培养皿和吸头；注意防止孔间溢流。培养（8.3.2）：用无菌胶带封板，44 °C ± 0,5 °C培养至少36 h、至多72 h，不得倾斜。读数（8.4）：带胶带的平板置于紫外观察箱中；呈蓝色荧光的孔为阳性；36 h后任何时间均可读数，因荧光不变。结果（第9章）：记录每个稀释度的阳性孔数；特征数，如游泳水64+/64和5+/32 → 32/5；地表水24/24、18/24、5/24、1/24 → 18/5/1；废水16、16、12、5、0、0（每级16孔）→ 12/5/0；三个及以上稀释度时——按ISO 8199取三位数，尽可能以0结尾。MPN是在泊松分布假设下的密度统计估计值，附有置信区间；附录A或B的程序给出每毫升MPN及95 %区间；示例：32/5 → 7,56/ml，区间5,42–10,54，即756/100 ml（542–1054）；18/5/1 → 159,08/ml（101,99–248,11）；12/5/0 → 1724,61/ml（1003,98–2962,50）；无阳性孔时结果为“< n/100 ml”，n为所用方案中一个阳性孔对应的MPN。试验报告（第10章）：样品识别信息、方法和结果。

状态（卡片截至02.10.2026）。PN-EN ISO 7899-1:2002（波兰文版）卡片无“已废止”标注——标准现行有效：发布日期20-12-2002，45页，价格组S，卫生、环境与医学部门，KT 120水质——微生物和生物检测委员会，ICS 07.100.20，“采用：EN ISO 7899-1:1998 [IDT]、EN ISO 7899-1:1998/AC:2000 [IDT]、ISO 7899-1:1998/Cor 1:2000 [IDT]、ISO 7899-1:1998 [IDT]”。PKN以“PN-EN ISO 7899-1”检索（02.10.2026）仅显示此卡片。勘误Cor 1:2000的内容我们不知道。ISO是否在制定新版，我们未核查（iso.org拒绝从我们的服务器访问）。

法律文件。关于游泳水质量管理的指令2006/7/EC附件I（CELLAR数据库中的原文和最新合并版本，01.01.2014）：肠道肠球菌的参比分析方法为“ISO 7899-1或ISO 7899-2”；内陆水体限值：优良质量200、良好400（第95百分位）、合格330（第90百分位）cfu/100 ml；沿海和过渡水体为100、200和185 cfu/100 ml。我们未阅读波兰关于游泳水质量监督的条例——不说明其如何转化这些方法。

多少家实验室及以何种形式（认可范围数据库副本，数据截至17.09.2026，读取于02.10.2026）。编号7899-1出现在8家实验室的8条记录中：AB 216、AB 313、AB 521、AB 560、AB 565、AB 589、AB 631、AB 680。在PCA网站当前认可范围中（读取于02.10.2026，版次自11.07.2025至07.08.2026），8家均写作“PN-EN ISO 7899-1:2002”，AB 313写作“PN-EN-ISO 7899-1:2002”（EN后有连字符）。没有一行以粗斜体排印。“实验室”标签页检索以所输入文字开头的条目：以“PN-EN ISO 7899-1”检索显示7家实验室、7个项目，以“PN-EN-ISO 7899-1”检索——AB 313——已于02.10.2026在labcoda.pl生产服务器上用该标签页的查询核实。

实验室检测什么（PCA中的项目）。水、游泳区和偶尔用于游泳场所的水（AB 216、AB 313、AB 521），地表水（AB 560、AB 589），水（AB 565、AB 631、AB 680）——“肠道肠球菌最大可能数，微型化方法（MPN）”；AB 680为“肠球菌（粪链球菌）”。各处相邻项目均列有PN-EN ISO 9308-3:2002（大肠埃希氏菌MPN，微型化方法）。

容易得到看似正确结果的环节。稀释液：SD稀释液含海盐——纯NaCl溶液明显抑制生长；海水（盐度> 30 g/kg）的第一级稀释用蒸馏水而非SD。稀释方案：稀释度和孔数取决于水的类型（表1）——游泳水方案（上限3,5 × 10⁴）用于废水会得到“超出范围”的结果。读数：阳性结果为暗处366 nm紫外光下的蓝色荧光；非粪源种（铅黄肠球菌、蒙氏肠球菌）也呈阳性——在含植物材料的水或工业废水中会使“肠道肠球菌”计数偏高。计算：按ISO 8199选择特征数（三个稀释度时——三位数，尽可能以0结尾）；程序给出的MPN以每毫升计——须同时给出换算到100 ml的结果和置信区间。培养基：微孔板生产须满足附录E的判据——不满足判据的平板会给出看似正确的MPN。操作：乙酸铊和N,N-二甲基甲酰胺有毒。

我们未提供的内容。我们没有第1–3章（试读本中为空白页）和附录A–G——因此不提供MPN表、计算程序、微孔板中培养基的质量判据（附录E）、校准微孔板的制备（附录F）或精密度数据。

方法原理

将稀释后的水样每孔200 µl加入含脱水MUD/SF培养基的微孔板；44 °C下36–72 h后，肠球菌水解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷，孔在366 nm紫外光下发出蓝色荧光；由各稀释度的阳性孔数计算每100 ml最大可能数（MPN）及95 %置信区间。

应用领域

• 游泳区和偶尔用于游泳场所的水——肠道肠球菌；指令2006/7/EC将ISO 7899-1或ISO 7899-2列为参比方法
• 地表水——肠道肠球菌MPN（4个稀释度，40至3,2 × 10⁶/100 ml）
• 废水和污水处理厂——最多6个稀释度（60至6,7 × 10⁸/100 ml）
• 海水和微咸水——盐度> 30 g/kg时采用单独的稀释方式

关键参数

标准

标准编号

PN-EN ISO 7899-1:2002 (wersja polska; EN ISO 7899-1:1998 z AC:2000 IDT, ISO 7899-1:1998 z Cor 1:2000 IDT)

标准名称（波兰语）

Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 1: Zminiaturyzowana metoda do badania wód powierzchniowych i ścieków (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)

标准名称（英语）

Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci in surface and waste water — Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium

分步操作程序

1. 样品和稀释

   按ISO 8199和ISO 5667取样；按表1确定稀释方案；淡水和微咸水——第一管起用SD，海水（> 30 g/kg）——第一管用蒸馏水。PN-EN ISO 7899-1:2002现行（卡片截至02.10.2026）。

2. 接种

   每个稀释度倒入无菌培养皿，用8通道移液器每孔200 µl分配到含MUD/SF培养基的孔中；每个稀释度用新培养皿和吸头。

3. 培养

   用无菌胶带封板；44 °C ± 0,5 °C培养36–72 h，不倾斜。

4. 读数

   在366 nm紫外观察箱中、暗处、带胶带读数；呈蓝色荧光的孔——阳性。

5. 计算

   按ISO 8199确定特征数；用程序（附录A或B）计算每毫升MPN及95 %区间，换算为100 ml；无阳性——“< n/100 ml”。

所需设备与仪器

试剂、培养基与耗材

职业健康与安全

• 标准警示：乙酸铊和N,N-二甲基甲酰胺有毒（化学通风橱），紫外线刺激皮肤和眼睛（手套、护目镜）；稀释和移液宜在生物安全柜中进行（气溶胶）；废水样品——感染性材料
• 技术提示：非粪源种（铅黄肠球菌、蒙氏肠球菌）计为肠道肠球菌——对含植物材料的水和工业废水解释结果时须考虑；用纯NaCl代替海盐会抑制生长

常见问题