🦠 水中粪肠球菌
以膜过滤法在 Slanetz-Bartley 培养基上检出并定量测定水中肠球菌，于胆汁-七叶苷-叠氮琼脂上确认。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 7899-2:2004
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 1 天 19 小时 37 分钟–2 天 3 小时 37 分钟
- 结果: cfu/100 mL（菌落形成单位）
- 限值（饮用水）: 0 cfu/100 mL
- 分离温度: 36 ± 1 °C（推定阶段）
概述
肠球菌是肠球菌属（Enterococcus）细菌 —— 主要为 E. faecalis 与 E. faecium —— 天然存在于人与温血动物的胃肠道。它们是公认的水体粪便污染指示菌，可与 E. coli 互为补充，但对环境条件、氯消毒与干燥的抵抗力强得多。
在 E. coli 可能迅速失活的情形下 —— 海水、经强消毒的水，以及评价陈旧粪便污染时 —— 肠球菌尤为有价值。肠球菌在水环境中的存活时间长于 E. coli，因而是处理工艺效能更好的标志物。
按 PN-EN ISO 7899-2 的方法分两个阶段：在 Slanetz-Bartley 培养基（含叠氮化钠与氯化三苯基四氮唑 TTC 的琼脂）上初筛分离，随后在胆汁-七叶苷-叠氮琼脂（BEA）上确认。肠球菌将 TTC 还原为红色甲臜，形成特征性的红至深红菌落；在 BEA 上水解七叶苷，使菌落周围呈深棕至黑色。
按卫生部条例，肠球菌是饮用水的必测项目，限值为 0 cfu/100 mL；在浴场水监测（2006/7/EC 指令）与瓶装水中同样必测。
方法原理
水样经 0,45 µm 滤膜过滤以截留细菌，滤膜置于 Slanetz-Bartley 培养基上，于 36±1 °C 培养 40–48 小时。培养基含叠氮化钠（抑制革兰氏阴性菌）与 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），肠球菌将其还原为不溶性红色甲臜 —— 推定菌落呈红色、深红或粉红色。随后将滤膜转移至胆汁-七叶苷-叠氮琼脂（BEA），于 44±0,5 °C 培养 2 小时。肠球菌将糖苷七叶苷水解为七叶素，后者与培养基中的铁离子反应生成深棕至黑色络合物 —— 即为确认。
应用领域
- 饮用水质量控制（波兰法律公报 2017 年 —— 肠球菌：0 cfu/100 mL）
- 浴场水监测（2006/7/EC 指令）
- 瓶装水与泉水检测
- 水消毒效能评价（氯化、紫外、臭氧）
- 海水与半咸水监测 —— 存活性优于 E. coli
- 地下水与渗滤取水口检测
- 泳池水质控制
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | cfu/100 mL（菌落形成单位） |
| 限值（饮用水） | 0 cfu/100 mL |
| 分离温度 | 36 ± 1 °C（推定阶段） |
| 确认温度 | 44 ± 0,5 °C（确认阶段） |
| 培养时间 | 40–48 小时（分离）+ 2 小时（确认） |
| 取样量 | 100 mL（标准） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 7899-2:2004
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- 标准名称（英语）
- Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method
分步操作程序
-
工作台准备
对过滤装置灭菌，准备 Slanetz-Bartley 与 BEA 平板，检查培养箱温度（36 °C 与 44 °C）。
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中和余氯
含余氯的样品加入硫代硫酸钠（1,8% 片剂），轻轻混匀。
-
膜过滤
将无菌 0,45 µm 滤膜置于滤器上，过滤 100 mL 样品，用 20 mL 无菌蛋白胨水冲洗滤杯。
-
推定阶段 —— Slanetz-Bartley
将滤膜转移至 Slanetz-Bartley 培养基，于 36±1 °C 培养 40–48 小时。
-
判读推定菌落
计数红色、深红或粉红色菌落（TTC 被还原为甲臜），记录菌落数量与分布。
-
确认阶段 —— BEA
将带菌落的滤膜移至 BEA 琼脂表面（不倒置），于 44±0,5 °C 培养 2 小时，培养结束后立即判读。
-
判读确认菌落
计数周围出现棕黑色晕圈的菌落（七叶苷水解），即为确认的肠球菌。
-
结果计算
结果 = 确认菌落数 / 取样体积 × 100，以 cfu/100 mL 报告。
-
质量控制
阳性对照：E. faecalis ATCC 29212 菌株；阴性对照：无菌水；培养基对照：无菌性与纯度。
-
废弃处置
所有带菌落的平板须高压灭菌（121 °C/30 分钟）后按感染性废物处置。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 膜过滤装置 | Sartorius Combisart、Merck EZ-Fit、Pall MicroFunnel | 3 000–12 000 PLN |
| 真空泵 | KNF Laboport N 810、Sartorius 16612 | 3 000–8 000 PLN |
| 36 °C 培养箱 | Binder BD 56、Memmert IN30、Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| 44 °C 精密培养箱 | Binder BD 23（控温 ±0,5 °C）、Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| 灭菌用高压灭菌器 | Tuttnauer ELV 2540、Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| 放大镜／菌落计数器 | Stuart SC6+、Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
| 生物安全柜 | Esco Airstream、Telstar Bio II Advance | 15 000–40 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Slanetz-Bartley 琼脂 | — | 含叠氮化钠与 TTC 的选择性培养基，用于肠球菌推定分离。厂商：Merck、Oxoid、Biokar |
| 胆汁-七叶苷-叠氮琼脂（BEA） | — | 确认培养基，含牛胆汁、七叶苷、柠檬酸铁铵与叠氮化钠 |
| 0,45 µm 滤膜 | — | 混合纤维素酯（MCE），直径 47 mm，无菌。Merck Millipore、Sartorius |
| 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC） | 298-96-4 | Slanetz-Bartley 培养基添加剂，浓度 0,1 g/L |
| 叠氮化钠（NaN₃） | 26628-22-8 | 培养基中的抑制剂，抑制革兰氏阴性菌。注意：剧毒！ |
| 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃） | 7772-98-7 | 用于中和自来水样品中的氯 |
| 林格液（1/4 浓度） | — | 用于稀释样品，无菌 9 mL 管装 |
职业健康与安全
- 叠氮化钠（NaN₃）—— 剧毒（H300、H310、H330）！致死剂量约 10 mg/kg。在通风柜中操作，佩戴手套与护目镜
- 肠球菌可引起医院感染（VRE）—— 须全套个人防护
- 培养后的生物材料 —— 处置前 121 °C/30 分钟高压灭菌
- 使用本生灯 —— 有烫伤风险
- 海水／浴场水 —— 可能含其他病原体，须格外谨慎
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 7899-2:2004 — 《Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method》。
该方法的原理是什么？
水样经 0,45 µm 滤膜过滤以截留细菌，滤膜置于 Slanetz-Bartley 培养基上，于 36±1 °C 培养 40–48 小时。培养基含叠氮化钠（抑制革兰氏阴性菌）与 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC），肠球菌将其还原为不溶性红色甲臜 —— 推定菌落呈红色、深红或粉红色。
测量范围和准确度是多少？
结果：cfu/100 mL（菌落形成单位）；限值（饮用水）：0 cfu/100 mL；分离温度：36 ± 1 °C（推定阶段）；确认温度：44 ± 0,5 °C（确认阶段）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 1 天 19 小时 37 分钟–2 天 3 小时 37 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
膜过滤装置、真空泵、36 °C 培养箱、44 °C 精密培养箱、灭菌用高压灭菌器、放大镜／菌落计数器、生物安全柜。核心仪器的参考价格（膜过滤装置）：3 000–12 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
饮用水质量控制（波兰法律公报 2017 年 —— 肠球菌：0 cfu/100 mL）；浴场水监测（2006/7/EC 指令）；瓶装水与泉水检测；水消毒效能评价（氯化、紫外、臭氧）；海水与半咸水监测 —— 存活性优于 E. coli；地下水与渗滤取水口检测；泳池水质控制。
需要采取哪些安全防护措施？
叠氮化钠（NaN₃）—— 剧毒（H300、H310、H330）！致死剂量约 10 mg/kg。在通风柜中操作，佩戴手套与护目镜；肠球菌可引起医院感染（VRE）—— 须全套个人防护；培养后的生物材料 —— 处置前 121 °C/30 分钟高压灭菌；使用本生灯 —— 有烫伤风险；海水／浴场水 —— 可能含其他病原体，须格外谨慎。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 7899-2。