🦠 食品和饲料中的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）——在BPW中增菌并在VRBG琼脂上分离的检出法
三句话速览
把样品（如10 g + 90 ml）在缓冲蛋白胨水中于37 °C（或30 °C）增菌18 h ± 2 h，用接种环划线接种于VRBG琼脂（37 °C，24 h ± 2 h），粉红色至红色或紫色的菌落再用氧化酶试验（阴性）和OF培养基中的葡萄糖发酵（呈黄色）加以确证；结果表示为在x g或x ml中检出／未检出。该检测依据 PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017)；适用范围：预期数量 < 100/g或/ml；需要复苏的细胞。整个程序共 8 个步骤；主要用于：预期肠杆菌科数量低于100/g或100/ml、或细胞需要复苏的食品和饲料（热处理后、干燥、冷冻的产品）、来自初级生产、食品生产和流通企业的环境样品（表面、设备的擦拭样）、过程卫生指标——在37 °C下增菌和分离。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 8
- 称样量: 针对10 g或10 ml验证；在BPW中1:10稀释（如10 g + 90 ml）
- 增菌: BPW，37 °C（或30 °C），18 h ± 2 h
- 分离: VRBG琼脂，37 °C，24 h ± 2 h；菌落粉红色至红色或紫色，带或不带晕圈
概述
ISO 21528-1:2017规定了检出肠杆菌科的增菌法。它适用于供人食用和动物饲用的产品，以及来自初级生产、食品生产和流通领域的环境样品。当所寻找的微生物可能需要通过增菌来复苏，以及当其预期数量低于每毫升或每克样品100个时，该方法是适宜的。其局限在于该方法易受较大变异性的影响（标准第11章）。数量的测定可在液体培养基中培养后用最可能数法（MPN）进行（附录A）。该标准针对10 g或10 ml的称样量进行了验证。
当把肠杆菌科作为卫生指标进行检验时，增菌和分离采用37 °C；出于工艺目的、需要同时涵盖嗜冷肠杆菌科时则选用30 °C。用菌落计数法测定肠杆菌科数量则由标准的第2部分（ISO 21528-2）规定——委员会第2073/2005号条例（欧共体）在过程卫生标准中（其中包括去脏后的胴体）指明它为参比方法。在波兰第1部分以PN-EN ISO 21528-1:2017-08施行；更早的PN-ISO 21528-1:2005涉及经预增菌的MPN法检出与计数。在食品微生物学教学中（UWM，瓦尔米亚－马祖里大学），同样的流程——缓冲蛋白胨水37 °C/18 h、在VRBG上37 °C/24 h分离、暗红色菌落、氧化酶确证（10 s内不变色）和葡萄糖发酵——被描述为检出该科杆菌的标准途径。
方法原理
用称样量接种缓冲蛋白胨水（BPW）并在37 °C（或30 °C）下培养18 h；通常把10 g样品与90 ml BPW混合，得到十倍稀释液。增菌后用接种环把培养物划线接种于结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBG）表面，并在37 °C下培养；24 h后观察平板，寻找肠杆菌科的典型推定菌落——粉红色至红色或紫色，带或不带胆盐沉淀晕圈。选取的菌落（至少一个典型或可疑菌落，结果为阴性时至多取四个后续菌落；每种形态各取一个）转接到非选择性培养基上（如营养琼脂，37 °C，24 h ± 2 h），并用两项试验确证：氧化酶反应（浸有氧化酶试剂的滤纸或市售的纸片；10 s内不出现深蓝紫色为阴性；用铂铱接种环，绝不可用镍铬接种环），以及葡萄糖发酵试验——把氧化酶阴性的菌落穿刺接种于含葡萄糖的OF培养基中，覆盖至少1 cm无菌矿物油，在37 °C下培养24 h ± 2 h；试管中全部内容物呈黄色即为阳性反应。某些肠杆菌科会使菌落或培养基褪色，因此在没有特征性菌落时选取近白色的菌落进行确证。结果表示为在x g或x ml产品的称样量中或在所擦拭的表面上检出或未检出肠杆菌科。
应用领域
- 预期肠杆菌科数量低于100/g或100/ml、或细胞需要复苏的食品和饲料（热处理后、干燥、冷冻的产品）
- 来自初级生产、食品生产和流通企业的环境样品（表面、设备的擦拭样）
- 过程卫生指标——在37 °C下增菌和分离
- 需计入嗜冷肠杆菌科的工艺目的——30 °C的变体
- 半定量：在液体培养基中培养后测定MPN（标准附录A）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 称样量 | 针对10 g或10 ml验证；在BPW中1:10稀释（如10 g + 90 ml） |
| 增菌 | BPW，37 °C（或30 °C），18 h ± 2 h |
| 分离 | VRBG琼脂，37 °C，24 h ± 2 h；菌落粉红色至红色或紫色，带或不带晕圈 |
| 确证 | 氧化酶阴性（10 s内不显色）+ 矿物油封盖下OF培养基中的葡萄糖发酵（呈黄色），37 °C，24 h ± 2 h |
| 适用范围 | 预期数量 < 100/g或/ml；需要复苏的细胞 |
| 结果 | 在x g、x ml中或在表面上检出／未检出肠杆菌科 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017)
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 1: Wykrywanie Enterobacteriaceae
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae
分步操作程序
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称样量与初始悬液
称取称样量（标准针对10 g或10 ml验证）并与九倍体积的BPW混合（如10 g + 90 ml），得到十倍稀释液；按标准也可使用较小的称样量。
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增菌
把初始悬液在37 °C（出于工艺目的则为30 °C）下培养18 h ± 2 h。
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在VRBG上分离
用接种环从增菌培养物划线接种VRBG琼脂平板表面，并在37 °C下培养24 h ± 2 h。
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菌落的选取
标记可疑菌落（粉红色至红色或紫色，带或不带胆盐沉淀晕圈）。至少选取一个典型菌落；若确证结果为阴性——至多再取四个。出现多种形态时每种各取一个；没有特征性菌落时选取近白色的菌落。
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转接
把每个选取的菌落接种于非选择性培养基（如营养琼脂）并在37 °C下培养24 h ± 2 h；取分离良好的菌落用于试验。
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氧化酶试验
用铂铱接种环、金属丝或玻璃棒把部分菌落涂在浸有氧化酶试剂的滤纸上（或市售纸片上）。10 s内滤纸不呈深蓝紫色即为阴性反应。
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葡萄糖发酵试验
把氧化酶阴性的菌落用金属丝穿刺接种于含葡萄糖的OF培养基试管中，覆盖至少1 cm厚的无菌矿物油层，并在37 °C下培养24 h ± 2 h。试管中全部内容物呈黄色 = 阳性反应。
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结果
把氧化酶阴性且发酵葡萄糖的菌落判定为肠杆菌科。报出：在x g或x ml产品的称样量中或在所擦拭的表面上检出／未检出。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱37 °C ± 1 °C（或30 °C ± 1 °C） | 增菌、分离、转接和OF试验 | — |
| 干燥箱（对流式）或25–50 °C培养箱 | 干燥平板表面 | — |
| 水浴47–50 °C | 琼脂培养基的保温 | — |
| 10 ml、1 ml和0.1 ml的校准移液管或自动移液器 | 无菌 | — |
| 在25 °C下准确度为 ± 0.1 pH单位的pH计 | 培养基pH的控制 | — |
| 铂铱接种环、金属丝或玻璃棒 | 用于氧化酶试验——不得使用镍铬接种环 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 肠杆菌科的非选择性增菌（复苏） |
| VRBG琼脂（结晶紫、中性红、胆盐、葡萄糖） | — | 推定肠杆菌科的选择性分离 |
| 营养琼脂（非选择性培养基） | — | 确证前所选菌落的转接 |
| 氧化酶试剂（滤纸、纸片或市售试条） | — | 氧化酶试验——肠杆菌科为氧化酶阴性 |
| 含葡萄糖的OF培养基和无菌矿物油 | — | 葡萄糖发酵试验（整个试管呈黄色） |
职业健康与安全
- 肠杆菌科包括肠道病原菌（Salmonella、致病性E. coli）——在微生物实验室条件下操作，对用过的培养物消毒并高压灭菌
- 矿物油和氧化酶试剂——避免接触皮肤和眼睛
- 47–50 °C的琼脂培养基——倾注时有烫伤风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 21528-1:2017-08 (ISO 21528-1:2017) — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 1: Detection of Enterobacteriaceae》。
该方法的原理是什么？
用称样量接种缓冲蛋白胨水（BPW）并在37 °C（或30 °C）下培养18 h；通常把10 g样品与90 ml BPW混合，得到十倍稀释液。增菌后用接种环把培养物划线接种于结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBG）表面，并在37 °C下培养；24 h后观察平板，寻找肠杆菌科的典型推定菌落——粉红色至红色或紫色，带或不带胆盐沉淀晕圈。
测量范围和准确度是多少？
称样量：针对10 g或10 ml验证；在BPW中1:10稀释（如10 g + 90 ml）；增菌：BPW，37 °C（或30 °C），18 h ± 2 h；分离：VRBG琼脂，37 °C，24 h ± 2 h；菌落粉红色至红色或紫色，带或不带晕圈；确证：氧化酶阴性（10 s内不显色）+ 矿物油封盖下OF培养基中的葡萄糖发酵（呈黄色），37 °C，24 h ± 2 h。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 8 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱37 °C ± 1 °C（或30 °C ± 1 °C）、干燥箱（对流式）或25–50 °C培养箱、水浴47–50 °C、10 ml、1 ml和0.1 ml的校准移液管或自动移液器、在25 °C下准确度为 ± 0.1 pH单位的pH计、铂铱接种环、金属丝或玻璃棒。
该检测用于哪些场景？
预期肠杆菌科数量低于100/g或100/ml、或细胞需要复苏的食品和饲料（热处理后、干燥、冷冻的产品）；来自初级生产、食品生产和流通企业的环境样品（表面、设备的擦拭样）；过程卫生指标——在37 °C下增菌和分离；需计入嗜冷肠杆菌科的工艺目的——30 °C的变体；半定量：在液体培养基中培养后测定MPN（标准附录A）。
需要采取哪些安全防护措施？
肠杆菌科包括肠道病原菌（Salmonella、致病性E. coli）——在微生物实验室条件下操作，对用过的培养物消毒并高压灭菌；矿物油和氧化酶试剂——避免接触皮肤和眼睛；47–50 °C的琼脂培养基——倾注时有烫伤风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 21528-1。