🦠 食品中肠杆菌科
采用带覆盖层的倾注平板法在 VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖）琼脂上于 37°C 培养 24 h 计数食品中的肠杆菌科细菌。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 21528-2:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 8
- 各步骤合计时间: 2 天 50 分钟
- 培养温度: 37 ± 1°C
- 培养时间: 24 ± 2 h
- 培养基: VRBG 琼脂（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）
概述
肠杆菌科（Enterobacteriaceae）是一个庞大的革兰氏阴性菌科，包含许多具有卫生学和致病学意义的属——埃希氏菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、克罗诺杆菌属等。它是公认的食品生产总体卫生状况指示菌，与大肠埃希氏菌测定（粪便污染指示）互为补充。
PN-EN ISO 21528-2 标准描述了计数食品和环境样品中肠杆菌科的水平法。方法采用 VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）——一种选择性鉴别培养基，其中结晶紫和胆盐抑制革兰氏阳性菌及其他非肠杆菌科微生物的生长。葡萄糖取代乳糖（VRBL 中所用），使培养基可检出全部肠杆菌科成员，而不仅是大肠菌群。
肠杆菌科在 VRBG 上的菌落呈红色至深紫色，周围有胆盐沉淀圈。倾注平板法加覆盖琼脂层可形成近似厌氧的条件，抑制非发酵型革兰氏阴性菌生长并促进葡萄糖发酵。
该方法在（EC）2073/2005 号法规中作为卫生指标使用，涉及乳粉、婴幼儿食品和即食产品等。在乳品工业中尤为重要，肠杆菌科检出提示可能存在巴氏杀菌后污染。
方法原理
将样品倾注接种于 VRBG 培养基。胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌。肠杆菌科将葡萄糖发酵产酸，酸与中性红作用使菌落呈红紫色。酸还使菌落周围的胆盐沉淀（形成沉淀圈）。倾注后再覆盖一层 VRBG 琼脂，限制氧气进入并抑制需氧非发酵菌生长。于 37°C 培养 24 h。
应用领域
- 食品生产卫生指标 — （EC）2073/2005 号法规
- 乳粉和婴幼儿配方粉质量控制
- 巴氏杀菌后污染监测
- 即食（RTE）产品检验
- 肉类及肉制品质量控制
- 生产车间环境监测（表面、水）
- 生产线清洗消毒有效性验证
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养温度 | 37 ± 1°C |
| 培养时间 | 24 ± 2 h |
| 培养基 | VRBG 琼脂（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂） |
| 菌落特征 | 红色至深紫色，带胆盐沉淀圈 |
| 接种方式 | 倾注平板加覆盖层 |
| 确证 | 氧化酶试验（阴性）+ 葡萄糖发酵试验（阳性） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 21528-2:2017
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique
分步操作程序
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样品制备
称取 10 g 样品于均质袋中，加入 90 mL BPW，均质 60–120 s。制备十倍稀释系列。
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倾注平板
将每个稀释度各 1 mL 移入两个无菌培养皿。15 min 内倾入约 10 mL 冷却至 44–47°C 的 VRBG 培养基。用旋转动作轻轻混匀。静置凝固。
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覆盖层
琼脂凝固后，在表面再加约 10 mL VRBG 培养基（44–47°C）。静置凝固。覆盖层限制氧气进入。
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培养
将平板倒置，于 37 ± 1°C 培养 24 ± 2 h。
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菌落读取
计数典型菌落 — 红色至深紫色，直径 0,5 mm 或以上，有或无沉淀圈。选取菌落总数 15–300 的平板计数。
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确证（可选）
挑取至少 5 个典型菌落。进行氧化酶试验（阴性 = 肠杆菌科）。接种带杜氏小管的葡萄糖肉汤 — 37°C 培养 24 h（结果：发酵葡萄糖 + 产气）。
-
计算
以加权平均计算肠杆菌科数。若进行了确证，需计入确证菌落百分比。结果以 CFU/g 表示。
-
质量控制
阳性对照：E. coli ATCC 25922（典型菌落，氧化酶阴性）。阴性对照：铜绿假单胞菌 ATCC 27853（不生长或非典型菌落，氧化酶阳性）。培养基无菌性对照。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 37°C 实验室培养箱 | Binder BD 56、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| 44–47°C 水浴 | Memmert WNB 14、Julabo TW 12、POL-EKO LW-4 | 3 000–10 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400、Interscience BagMixer | 12 000–25 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 300、Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| VRBG 琼脂（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂） | 548-62-9 | 选择性鉴别培养基：明胶蛋白胨、酵母浸粉、胆盐、葡萄糖、结晶紫、中性红、NaCl、琼脂；500 g 装 |
| 结晶紫 | 548-62-9 | 抑制革兰氏阳性菌的染料；浓度 0,002 g/L |
| 胆盐（混合胆盐） | — | 抑制革兰氏阳性菌和非发酵菌的选择性成分；1,5 g/L |
| 中性红 | 553-24-2 | pH 指示剂 — 使发酵葡萄糖的菌落呈红色；0,03 g/L |
| D-葡萄糖 | 50-99-7 | 肠杆菌科可发酵的碳源；10 g/L |
| 葡萄糖肉汤 | — | 用于葡萄糖发酵试验（确证），配杜氏小管 |
| 氧化酶试剂（Kovács） | — | 用于氧化酶试验 — 肠杆菌科氧化酶阴性；试纸条或滴剂 |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于样品稀释，500 g 装 |
职业健康与安全
- 肠杆菌科含致病菌（沙门氏菌、大肠埃希氏菌）— 须使用个人防护装备
- 必须在 II 级生物安全柜中操作
- 结晶紫 — 会染色皮肤，佩戴手套
- 使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
- 用 70% 乙醇或次氯酸钠对台面消毒
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 21528-2:2017 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique》。
该方法的原理是什么？
将样品倾注接种于 VRBG 培养基。胆盐和结晶紫抑制革兰氏阳性菌。
测量范围和准确度是多少？
培养温度：37 ± 1°C；培养时间：24 ± 2 h；培养基：VRBG 琼脂（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）；菌落特征：红色至深紫色，带胆盐沉淀圈。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 2 天 50 分钟。整个程序共 8 个步骤。
需要哪些设备？
37°C 实验室培养箱、44–47°C 水浴、II 级生物安全柜、拍击式均质器、实验室高压灭菌器、菌落计数器。核心仪器的参考价格（37°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
食品生产卫生指标 — （EC）2073/2005 号法规；乳粉和婴幼儿配方粉质量控制；巴氏杀菌后污染监测；即食（RTE）产品检验；肉类及肉制品质量控制；生产车间环境监测（表面、水）；生产线清洗消毒有效性验证。
需要采取哪些安全防护措施？
肠杆菌科含致病菌（沙门氏菌、大肠埃希氏菌）— 须使用个人防护装备；必须在 II 级生物安全柜中操作；结晶紫 — 会染色皮肤，佩戴手套；使用过的材料须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃；用 70% 乙醇或次氯酸钠对台面消毒。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 21528-2。