💊 细菌内毒素检查（LAL）
用鲎试剂法（LAL — 鲎变形细胞溶解物）检出并定量测定药品中的细菌内毒素（脂多糖 LPS）。注射剂的关键安全性检验。
要点速览
- 标准: European Pharmacopoeia 2.6.14
- 类别: 制药与化妆品
- 操作步骤数: 6
- 各步骤合计时间: 2 小时
- 试验灵敏度（λ）: 通常 0,03–0,25 EU/mL
- 范围: 0,005–50 EU/mL（显色法/浊度法）
- 注射用水限值: <0,25 EU/mL
概述
细菌内毒素（脂多糖 — LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的碎片，属最强的热原之一。注射剂中即使痕量内毒素也可导致发热、感染性休克乃至患者死亡。LAL 试验（鲎变形细胞溶解物）利用鲎（Limulus polyphemus）血细胞溶解物，其在内毒素存在下发生凝固。
欧洲药典（2.6.14）规定了三种试验方法：（A）凝胶法 — 定性，（B）浊度动力学法 — 定量，（C）显色动力学法 — 定量。内毒素限值：注射用水 <0,25 EU/mL，注射药物按 K/M 公式计算（K = 致热阈值，M = 最大剂量）。
方法原理
鲎变形细胞溶解物（LAL）含级联酶（C 因子），可被内毒素（LPS）激活。凝胶法中，激活导致形成坚实凝胶（凝固）。浊度法中 — 产生浊度（凝固蛋白聚合）。显色法中 — 水解显色底物（释放对硝基苯胺 — 黄色，405 nm 处测定）。试验灵敏度：0,005–50 EU/mL。
应用领域
- 注射用水（WFI）质量控制
- 注射剂和输液剂批次放行
- 接触血液的医疗器械检验
- 透析液和静脉输液控制
- 药用原料（原料药、辅料）检验
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 试验灵敏度（λ） | 通常 0,03–0,25 EU/mL |
| 范围 | 0,005–50 EU/mL（显色法/浊度法） |
| 注射用水限值 | <0,25 EU/mL |
| 注射药物限值 | K/M（K=5 EU/kg，M=最大剂量/kg/h） |
| 试验时间 | 60 min（凝胶法）、15–60 min（动力学法） |
标准
- 标准编号
- European Pharmacopoeia 2.6.14
- 标准名称（波兰语）
- Badanie endotoksyn bakteryjnych — Test LAL (Limulus Amebocyte Lysate)
- 标准名称（英语）
- Bacterial endotoxins
分步操作程序
-
工位准备
在洁净室（B/C 级）或层流罩内操作。所有玻璃器皿须无热原（250°C/30 min）。佩戴无粉手套。
-
LAL 复溶
向 LAL 瓶中加入 LRW。轻轻混匀（勿涡旋）。复溶后 1 h 内使用。
-
标准液配制
用 LRW 配制 CSE 稀释系列：50、5、0,5、0,05 EU/mL（1:10 逐级）。
-
样品制备
将样品稀释至 MVD（最大有效稀释度 = 内毒素限值浓度 × LAL 灵敏度）。
-
凝胶法试验（A 法）
向含 0,1 mL LAL 的试管中加入 0,1 mL 样品/标准液。37 ± 1°C 孵育 60 ± 2 min。翻转 180° — 凝胶坚实即为阳性。
-
结果判读
凝胶法：翻转后凝胶不脱落 = 阳性，散开 = 阴性。动力学法：由校准曲线读取（EU/mL）。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| LAL 动力学读数仪 | Charles River Endosafe nexgen-PTS、Lonza PyroGene | 40 000–120 000 PLN |
| 37°C 金属浴 | 读数仪内置或外置干式金属浴 | 5 000–15 000 PLN |
| 无热原移液器 | Eppendorf Research Plus 配无热原吸头 | 800–2 000 PLN |
| 无热原试管（经去热原处理） | 硼硅玻璃试管，250°C/30 min | 2–5 PLN / 支 |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| LAL 试剂 | — | 鲎变形细胞溶解物，冻干品（Charles River、Lonza、Fujifilm Wako） |
| 内毒素标准品（CSE/RSE） | — | 控制标准内毒素，冻干品，对 WHO RSE 定值，如 10 000 EU/瓶 |
| LAL 试剂用水（LRW） | — | 无热原水，<0,005 EU/mL |
| 显色底物（C 法用） | — | 肽-pNA，被激活的因子水解 |
职业健康与安全
- 内毒素 — 具致热性，须避免污染样品和试剂
- 在洁净室中操作 — 遵守 GMP 程序
- LAL 来自受保护物种（鲎）— 应节约使用
- 生物废物 — 须高压灭菌后再处置
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 European Pharmacopoeia 2.6.14 — 《Bacterial endotoxins》。
该方法的原理是什么？
鲎变形细胞溶解物（LAL）含级联酶（C 因子），可被内毒素（LPS）激活。凝胶法中，激活导致形成坚实凝胶（凝固）。
测量范围和准确度是多少？
试验灵敏度（λ）：通常 0,03–0,25 EU/mL；范围：0,005–50 EU/mL（显色法/浊度法）；注射用水限值：<0,25 EU/mL；注射药物限值：K/M（K=5 EU/kg，M=最大剂量/kg/h）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 2 小时。整个程序共 6 个步骤。
需要哪些设备？
LAL 动力学读数仪、37°C 金属浴、无热原移液器、无热原试管（经去热原处理）。核心仪器的参考价格（LAL 动力学读数仪）：40 000–120 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
注射用水（WFI）质量控制；注射剂和输液剂批次放行；接触血液的医疗器械检验；透析液和静脉输液控制；药用原料（原料药、辅料）检验。
需要采取哪些安全防护措施？
内毒素 — 具致热性，须避免污染样品和试剂；在洁净室中操作 — 遵守 GMP 程序；LAL 来自受保护物种（鲎）— 应节约使用；生物废物 — 须高压灭菌后再处置。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 Ph.Eur. 2.6.14。