🦠 食品中β-葡糖醛酸酶阳性大肠埃希氏菌
采用倾注平板法在 TBX 琼脂上于 44°C 计数食品中β-葡糖醛酸酶阳性的大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌菌落呈特征性蓝绿色。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 16649-2:2004
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 22 小时 50 分钟–1 天 4 小时 50 分钟
- 培养温度: 44 ± 1°C
- 培养时间: 18–24 h
- 培养基: TBX 琼脂（胰蛋白胨胆盐 X-葡糖苷酸）
概述
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是食品粪便污染最重要的指示菌。食品中检出大肠埃希氏菌表明生产卫生不达标、热处理不当或巴氏杀菌后二次污染。PN-EN ISO 16649-2 标准规定了计数β-葡糖醛酸酶阳性大肠埃希氏菌的水平法，利用该菌分解显色底物 X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸）的能力。
方法基于在 TBX（Tryptone Bile X-glucuronide Agar，胰蛋白胨胆盐 X-葡糖苷酸琼脂）培养基上倾注平板并于 44°C 培养 18–24 h。在此条件下，大肠埃希氏菌因β-葡糖醛酸酶水解显色底物而形成特征性蓝绿色菌落。约 96–97% 的大肠埃希氏菌菌株具有β-葡糖醛酸酶活性，因此该方法特异性很高。
方法的一个重要局限在于：大肠埃希氏菌 O157:H7 菌株——最危险的食源性病原菌之一——大多为β-葡糖醛酸酶阴性，本方法检测不出。因此 STEC/VTEC 需采用单独方法（如 PN-EN ISO 13136）。该方法也不适用于在 44°C 下生长不良的所有大肠埃希氏菌菌株。
该检验为波兰及欧盟食品安全法规所要求，包括关于食品微生物标准的（EC）2073/2005 号法规。广泛应用于乳制品、肉类、蔬菜、海产品和饮用水的质量控制。
方法原理
方法利用大肠埃希氏菌产生β-葡糖醛酸酶（GUD）的能力，该酶水解 TBX 培养基中所含的显色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸（X-Gluc）。水解释放出吲哚酚，经氧化和二聚生成不溶性蓝色色素（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）。大肠埃希氏菌菌落因而呈特征性蓝绿色。培养基中的胆盐抑制革兰氏阳性菌生长，保证选择性。44°C 培养进一步限制非大肠埃希氏菌的生长。
应用领域
- 食品微生物质量控制（肉类、乳制品、蔬菜、海产品）
- 符合（EC）2073/2005 号法规 — 微生物标准
- 食品厂生产过程卫生监测
- 饮用水和食品生产用水检验
- 巴氏杀菌和热处理有效性验证
- HACCP 和 GHP/GMP 体系验证
- 卫生监督和兽医监督的官方检查
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养温度 | 44 ± 1°C |
| 培养时间 | 18–24 h |
| 培养基 | TBX 琼脂（胰蛋白胨胆盐 X-葡糖苷酸） |
| 定量限 | 10–3 × 10⁵ CFU/g（稀释度 10⁻¹ 至 10⁻⁴） |
| 菌落特征 | 蓝绿色菌落（β-葡糖醛酸酶 +） |
| 接种方式 | 倾注平板，每皿 1 mL |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 16649-2:2004
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda liczenia kolonii w temperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide
分步操作程序
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样品制备
称取 25 g（或 10 g）样品于均质袋中。加入 225 mL（或 90 mL）缓冲蛋白胨水（BPW）。在拍击式均质器中均质 60–120 s。所得为 10⁻¹ 稀释液。
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制备稀释系列
转移 1 mL 至 9 mL 稀释液，制备十倍稀释系列（10⁻²、10⁻³、10⁻⁴）。每个稀释度更换新吸头。
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倾注平板
将每个稀释度各 1 mL 移入两个无菌培养皿（平行样）。15 min 内倾入约 15 mL 冷却至 44–47°C 的 TBX 培养基。
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混匀与凝固
用旋转和往复动作将接种物与培养基轻轻混匀。将平板置于水平面上待琼脂凝固（约 10–15 min）。
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复苏（可选）
若怀疑细胞受损（如冷冻样品），在转入 44°C 前先于 37°C 培养 4 h 以便复苏。
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培养
将平板倒置，于 44 ± 1°C 培养 18–24 h。
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结果读取
计数β-葡糖醛酸酶阳性大肠埃希氏菌的典型蓝绿色菌落。选取菌落总数（典型和非典型）在 15–300 之间的平板计数。
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计算
按公式以两个相邻稀释度的加权平均计算大肠埃希氏菌数：N = ΣC /（V × 1,1 × d），其中 ΣC — 菌落数之和，V — 接种体积，d — 稀释度。结果以 CFU/g 或 CFU/mL 表示。
-
质量控制
同步进行阴性对照（不接种的培养基）和阳性对照（标准菌株 E. coli ATCC 25922）。检查蛋白胨水的无菌性。
-
记录与报告
在实验记录本中记录结果，包括样品标识、培养基批号、培养温度和计算过程。报告结果以 CFU/g 表示并给出测量不确定度。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 44°C 实验室培养箱 | Binder BD 56/115、Memmert INB 200、POL-EKO CLN 53 | 5 000–18 000 PLN |
| 44–47°C 水浴 | Memmert WNB 14、Julabo TW 12、POL-EKO LW-4 | 3 000–10 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream | 25 000–60 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65、SMS Prestige Medical | 15 000–45 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator、BagMixer 400 | 12 000–25 000 PLN |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 300、BZG Colony Star、Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
| 1 mL 移液器 | Eppendorf Research Plus、Gilson Pipetman、HTL Discovery Comfort | 400–1 200 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| TBX 琼脂（胰蛋白胨胆盐 X-葡糖苷酸琼脂） | 114162-64-0 | 含胰蛋白胨、胆盐和 X-Gluc 的显色培养基；成品袋装或平板，500 g / 20 皿装 |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸（X-Gluc） | 114162-64-0 | β-葡糖醛酸酶显色底物，TBX 组分，1–5 g 装 |
| 胰蛋白胨（酪蛋白胨） | 91079-40-2 | TBX 培养基中的氮源和氨基酸来源 |
| 胆盐（Bile Salts No. 3） | — | 抑制革兰氏阳性菌的选择性成分，浓度 1,5 g/L |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于制备样品的十倍系列稀释液，500 g 装 |
| 细菌学琼脂 | 9002-18-0 | 凝胶剂，500 g 装 |
职业健康与安全
- 处理潜在感染性材料 — 佩戴一次性手套、实验服和护目镜
- 所有敞开样品的操作均须在 II 级生物安全柜中进行
- 使用过的培养基和样品须先高压灭菌（121°C，15 min）再废弃
- 用 70% 乙醇或含氯制剂对工作台面消毒
- 遵守无菌操作规程 — 存在肠致病性大肠埃希氏菌感染风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 16649-2:2004 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide》。
该方法的原理是什么？
方法利用大肠埃希氏菌产生β-葡糖醛酸酶（GUD）的能力，该酶水解 TBX 培养基中所含的显色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸（X-Gluc）。水解释放出吲哚酚，经氧化和二聚生成不溶性蓝色色素（5,5'-二溴-4,4'-二氯靛蓝）。
测量范围和准确度是多少？
培养温度：44 ± 1°C；培养时间：18–24 h；培养基：TBX 琼脂（胰蛋白胨胆盐 X-葡糖苷酸）；定量限：10–3 × 10⁵ CFU/g（稀释度 10⁻¹ 至 10⁻⁴）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 22 小时 50 分钟–1 天 4 小时 50 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
44°C 实验室培养箱、44–47°C 水浴、II 级生物安全柜、实验室高压灭菌器、拍击式均质器、菌落计数器、1 mL 移液器。核心仪器的参考价格（44°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
食品微生物质量控制（肉类、乳制品、蔬菜、海产品）；符合（EC）2073/2005 号法规 — 微生物标准；食品厂生产过程卫生监测；饮用水和食品生产用水检验；巴氏杀菌和热处理有效性验证；HACCP 和 GHP/GMP 体系验证；卫生监督和兽医监督的官方检查。
需要采取哪些安全防护措施？
处理潜在感染性材料 — 佩戴一次性手套、实验服和护目镜；所有敞开样品的操作均须在 II 级生物安全柜中进行；使用过的培养基和样品须先高压灭菌（121°C，15 min）再废弃；用 70% 乙醇或含氯制剂对工作台面消毒；遵守无菌操作规程 — 存在肠致病性大肠埃希氏菌感染风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 16649-2。