🦠 地表水和废水中的E. coli（大肠埃希氏菌）——微孔板上的微量化MPN法（MUG）
三句话速览
把样品的稀释液（1/2、1/20、1/200……）在含海盐的专用稀释液中制备，按每孔200 µl接种到装有脱水MUG/EC培养基的96孔板中，在(44 ± 0。该检测依据 PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000)；范围：浴场水15–3.5·10⁴；地表水40–3.2·10⁶；废水60–6.7·10⁸个E. coli/100 ml。整个程序共 7 个步骤；主要用于：浴场水水质监测——按第2006/7/WE号指令为E. coli的参比方法（内陆水、沿岸水和过渡水）、富含悬浮物而膜过滤不适用的地表水（河流、湖泊）、原废水和处理后的废水、污水处理厂的出水（范围至6.7·10⁸/100 ml）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 7
- 范围: 浴场水15–3.5·10⁴；地表水40–3.2·10⁶；废水60–6.7·10⁸个E. coli/100 ml
- 限制: 不用于生活饮用水，也不用于指导值 < 15/100 ml的水；不测定E. coli以外的大肠菌群
- 培养: (44 ± 0.5) °C，最少36 h，最多72 h
概述
ISO 9308-3:1998规定了通过接种液体培养基检出和定量测定地表水与废水中Escherichia coli的微量化方法；它适用于所有种类的地表水和废水，尤其是富含悬浮物的水。它不适用于生活饮用水，也不适用于指导值低于15个细菌/100 ml的其他水，并且不用于检出E. coli以外的大肠菌群。E. coli定义为在44 °C下于含4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖醛酸苷（MUG）的液体培养基中生长的β-D-葡糖醛酸酶阳性微生物。该方法已在实验室间试验中得到验证（附录D）。在欧盟，关于浴场水水质管理的第2006/7/WE号指令把ISO 9308-3或ISO 9308-1指明为测定内陆水以及沿岸水和过渡水中E. coli（CFU/100 ml）的参比方法。在波兰它以PN-EN ISO 9308-3:2002施行。
方法原理
把稀释后的样品接种到微孔板中装有脱水培养基的一排孔里。在(44 ± 0.5) °C下培养至少36 h、至多72 h后，在暗处于366 nm紫外光下观察板——MUG水解产生的蓝色荧光指示E. coli的存在；结果以每100 ml的最可能数（MPN）表示。MUG/EC培养基每1000 ml含胰蛋白胨40 g、水杨苷1 g、Triton X-100 1 g和MUG 100 mg（MUG溶于2 ml N,N-二甲基甲酰胺中），pH 6.9 ± 0.2，经0.2 µm过滤除菌，按每孔100 µl分装到96孔板（容量 ≥ 350 µl）中并立即在隧道式干燥箱或层流罩中脱水；其制备须符合附录E的质量准则。专用稀释液（SD）为每1000 ml水中含22.5 g合成海盐（可另加溴酚蓝以与水相区别），在(121 ± 3) °C下灭菌15–20 min；对海水（盐度 > 30 g/kg）则用去矿物质水作第一次稀释。稀释度和孔数的多少取决于预期的污染程度：浴场水——2个稀释度（64个1/2的孔和32个1/20的孔；范围15–3.5·10⁴/100 ml），淡水地表水——4个稀释度、每个24孔（40–3.2·10⁶），废水和污水处理厂——6个稀释度、每个16孔（60–6.7·10⁸）。由各稀释度的阳性孔数组成特征数，MPN和95 %置信区间由附录A或B的程序计算（泊松分布）；没有阳性孔时结果表示为“< n/100 ml”。
应用领域
- 浴场水水质监测——按第2006/7/WE号指令为E. coli的参比方法（内陆水、沿岸水和过渡水）
- 富含悬浮物而膜过滤不适用的地表水（河流、湖泊）
- 原废水和处理后的废水、污水处理厂的出水（范围至6.7·10⁸/100 ml）
- 海水和微咸水——得益于含海盐的稀释液
- 大批量系列检验——96孔板格式和多通道移液器
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 范围 | 浴场水15–3.5·10⁴；地表水40–3.2·10⁶；废水60–6.7·10⁸个E. coli/100 ml |
| 限制 | 不用于生活饮用水，也不用于指导值 < 15/100 ml的水；不测定E. coli以外的大肠菌群 |
| 培养 | (44 ± 0.5) °C，最少36 h，最多72 h |
| 读数 | 在366 nm紫外（伍德灯）下于暗处观察蓝色荧光；荧光不随时间改变 |
| 接种量 | 每孔200 µl；96孔板，350 µl，平底，不发荧光 |
| 稀释液SD | 每升22.5 g合成海盐；在(121 ± 3) °C下灭菌15–20 min |
| MUG/EC培养基 | 每升胰蛋白胨40 g、水杨苷1 g、Triton X-100 1 g、MUG 100 mg；pH 6.9 ± 0.2；0.2 µm过滤；每孔100 µl，脱水 |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000)
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 3: Zminiaturyzowana metoda wykrywania i oznaczania E. coli w wodach powierzchniowych i w ściekach (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii)
- 标准名称（英语）
- Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water — Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium
分步操作程序
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采样
按ISO 8199以及ISO 5667-1、-2和-3采样并送检。
-
稀释度的选择
按预期的污染程度选定稀释度和孔数（标准表1）：浴场水——64个1/2的孔和32个1/20的孔；地表水——4个稀释度、每个24孔；废水——至多6个稀释度、每个16孔。
-
稀释
向试管中各加9 ml稀释液SD（对盐度 > 30 g/kg的海水——第一支试管加9 ml去矿物质水）。用力混匀样品并移取9 ml至第一支试管（1/2），随后移1 ml至下一支（1/20），再依次各移1 ml（1/200等），每次更换移液管。在生物安全柜中操作（有气溶胶）。
-
接种微孔板
把试管内容物倒入90 mm无菌培养皿，用8通道移液器按每孔200 µl分配到相应稀释度的孔中；更换稀释度时更换培养皿和吸头。注意不要在孔间溢流。
-
培养
用无菌自粘封板膜封住板，在(44 ± 0.5) °C下培养36–72 h，不要使板倾斜。
-
读数
把带封膜的板放入紫外观察箱；凡呈蓝色荧光的孔均判为阳性（36 h后任何时间均可读数）。
-
计算
把每个稀释度的阳性孔数记为特征数（有 ≥ 3个稀释度时——三位数，最后一位尽可能为0，按ISO 8199）；用附录A或B的程序计算每ml的MPN和95 %置信区间并换算为每100 ml（如32/5 → 756/100 ml，542–1054）；没有阳性孔时给出“< n/100 ml”。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 恒温培养箱(44 ± 0.5) °C | — | |
| 紫外观察箱（伍德灯366 nm） | 在暗处读数；护目镜和防护手套 | — |
| 8通道移液器（200 µl）配无菌吸头 | 或其他每孔分配200 µl的加样系统 | — |
| 无菌96孔微孔板，350 µl，平底，不发荧光，配无菌自粘封板膜 | 装有脱水的MUG/EC培养基 | — |
| 隧道式干燥箱或层流罩（最好为II级） | 把板中的培养基脱水 | — |
| 0.2 µm膜过滤装置、pH计（± 0.1）、便携式折光仪（可选）、16 × 160和20 × 200 mm试管、90 mm无菌培养皿 | 培养基灭菌、盐度测量、稀释 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| MUG/EC培养基（胰蛋白胨、水杨苷、Triton X-100、MUG） | — | 检出E. coli的β-D-葡糖醛酸酶——荧光 |
| N,N-二甲基甲酰胺（每1000 ml培养基2 ml） | — | 溶解MUG；有毒且致癌——在通风柜中操作 |
| 合成海盐（22.5 g/l）——专用稀释液SD | — | 稀释用；可选加溴酚蓝，每100 ml 50 %乙醇中0.04 g作为染色剂 |
| 去矿物质水或蒸馏水，无菌 | — | 海水的第一次稀释；培养基的配制 |
职业健康与安全
- N,N-二甲基甲酰胺有毒并可能致癌；吸入、经皮和吞食均有害——在化学通风柜中操作
- 紫外辐射刺激眼睛和皮肤——读数时戴护目镜和防护手套
- 废水的稀释和移液会产生气溶胶——在生物安全柜中操作
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 9308-3:2002 (ISO 9308-3:1998 + Cor 1:2000) — 《Water quality — Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria in surface and waste water — Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) by inoculation in liquid medium》。
该方法的原理是什么？
把稀释后的样品接种到微孔板中装有脱水培养基的一排孔里。在(44 ± 0.
测量范围和准确度是多少？
范围：浴场水15–3.5·10⁴；地表水40–3.2·10⁶；废水60–6.7·10⁸个E. coli/100 ml；限制：不用于生活饮用水，也不用于指导值 < 15/100 ml的水；不测定E. coli以外的大肠菌群；培养：(44 ± 0.5) °C，最少36 h，最多72 h；读数：在366 nm紫外（伍德灯）下于暗处观察蓝色荧光；荧光不随时间改变。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 7 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
恒温培养箱(44 ± 0.5) °C、紫外观察箱（伍德灯366 nm）、8通道移液器（200 µl）配无菌吸头、无菌96孔微孔板，350 µl，平底，不发荧光，配无菌自粘封板膜、隧道式干燥箱或层流罩（最好为II级）、0.2 µm膜过滤装置、pH计（± 0.1）、便携式折光仪（可选）、16 × 160和20 × 200 mm试管、90 mm无菌培养皿。
该检测用于哪些场景？
浴场水水质监测——按第2006/7/WE号指令为E. coli的参比方法（内陆水、沿岸水和过渡水）；富含悬浮物而膜过滤不适用的地表水（河流、湖泊）；原废水和处理后的废水、污水处理厂的出水（范围至6.7·10⁸/100 ml）；海水和微咸水——得益于含海盐的稀释液；大批量系列检验——96孔板格式和多通道移液器。
需要采取哪些安全防护措施？
N,N-二甲基甲酰胺有毒并可能致癌；吸入、经皮和吞食均有害——在化学通风柜中操作；紫外辐射刺激眼睛和皮肤——读数时戴护目镜和防护手套；废水的稀释和移液会产生气溶胶——在生物安全柜中操作。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 9308-3。