🦠 水中大肠埃希氏菌与大肠菌群
以膜过滤法在显色 CCA 培养基上定量测定水中 E. coli 与大肠菌群。饮用水粪便污染的基本指标。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 19 小时 19 分钟–1 天 1 小时 19 分钟
- 结果: cfu/100 mL（菌落形成单位）
- 限值（饮用水）: E. coli：0 cfu/100 mL；大肠菌群：0 cfu/100 mL
- 培养温度: 36 ± 2 °C
概述
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是水体粪便污染最重要的指示菌。饮用水中检出 E. coli 表明受到人或动物粪便污染，并可能存在致病菌、病毒与肠道原虫的风险。大肠菌群（coliforms）范围更广 —— 除 E. coli 外还包括克雷伯氏菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌 —— 可作为处理工艺卫生状况的一般性指标。
按 PN-EN ISO 9308-1 的方法是将水样经 0,45 µm 滤膜过滤以截留细菌，再将滤膜置于选择性显色 CCA 培养基（显色大肠菌群琼脂）上。该培养基含酶底物：Salmon-GAL（6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）用于大肠菌群的 β-半乳糖苷酶，X-Glucuronide（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷）用于 E. coli 的 β-葡萄糖醛酸酶。
在 36±2 °C 培养 18–24 小时后，大肠菌群菌落呈粉红至红色（β-半乳糖苷酶活性），E. coli 菌落呈深蓝紫色（两种酶均有活性）。结果可直接判读 —— 无需生化确认，大大加快分析速度。
该方法适用于本底菌群少的水 —— 饮用水、处理后水、地下水。对地表水与污水（本底菌群多）应采用 PN-EN ISO 9308-2（Colilert 培养基 MPN 法）。
方法原理
水样经 0,45 µm 滤膜（直径 47 mm）过滤以截留细菌，滤膜转移至显色 CCA 培养基表面。培养基含两种显色底物：Salmon-GAL 被 β-半乳糖苷酶（大肠菌群的酶）水解，生成鲑肉粉色产物；X-Glucuronide 被 β-葡萄糖醛酸酶（E. coli 特有酶）水解，生成深蓝色产物。培养基的选择性由 Tergitol-7 提供，它可抑制革兰氏阳性菌与多数非大肠菌群的生长。
应用领域
- 饮用水质量控制（波兰法律公报 2017 年 —— E. coli：0 cfu/100 mL）
- 供水管网监测 —— 用户端取样点
- 地下水与取水口检测
- 处理与消毒后水的控制
- 瓶装水与泉水检测
- 公共建筑（医院、学校）用水监测
- 食品工业生产用水
- 应急检测 —— 供水管网事故后
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 结果 | cfu/100 mL（菌落形成单位） |
| 限值（饮用水） | E. coli：0 cfu/100 mL；大肠菌群：0 cfu/100 mL |
| 培养温度 | 36 ± 2 °C |
| 培养时间 | 18–24 小时 |
| 取样量 | 100 mL（标准）或 250 mL |
| 适宜计数范围 | 滤膜上 10–100 个菌落（最佳） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 1: Metoda filtracji membranowej do wód o małej ilości flory towarzyszącej
- 标准名称（英语）
- Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora
分步操作程序
-
工作台准备
对过滤装置灭菌（121 °C/15 分钟高压灭菌或火焰灼烧）。准备 CCA 平板 —— 使用前 30 分钟从冰箱取出。
-
中和余氯
若样品含氯（自来水），加入硫代硫酸钠（1,8% 片剂 —— 每 100 mL 样品 0,1 mL），轻轻混匀。
-
膜过滤
将无菌 0,45 µm 滤膜置于滤器上，倒入 100 mL 样品，开启真空泵。过滤后用 20 mL 无菌蛋白胨水冲洗滤杯。
-
将滤膜转移至培养基
用无菌镊子将滤膜移至 CCA 平板，确保滤膜平整贴合、下方无气泡。
-
培养
将平板倒置（底朝上）于 36±2 °C 培养箱中培养 18–24 小时，不得超过 24 小时。
-
判读 —— 大肠菌群
计数粉红至红色菌落（β-半乳糖苷酶阳性）= 大肠菌群。最佳计数范围：滤膜上 10–100 个菌落。
-
判读 —— E. coli
计数深蓝至紫色菌落（β-半乳糖苷酶与 β-葡萄糖醛酸酶均阳性）= E. coli。E. coli 计入大肠菌群总数。
-
氧化酶试验（确认）
将可疑菌落点在氧化酶试纸上。E. coli 为氧化酶阴性（不变色）。氧化酶阳性菌落应剔除。
-
结果计算
结果 = 每 100 mL 样品中确认菌落数。饮用水要求 E. coli 与大肠菌群均为 0 cfu/100 mL。
-
质量控制
每日做阴性对照（无菌水），每 10 个样品做平行样，并测定 CRM 控制样，回收率 90–110%。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 膜过滤装置 | Sartorius Combisart、Merck EZ-Fit、Pall MicroFunnel | 3 000–12 000 PLN |
| 真空泵 | KNF Laboport N 810、Sartorius 16612 | 3 000–8 000 PLN |
| 36 °C 细菌培养箱 | Binder BD 56、Memmert IN30、Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| 灭菌用高压灭菌器 | Tuttnauer ELV 2540、Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| 紫外灯／本生灯 | 操作台用 UVC 杀菌灯、Teclu 燃烧器 | 200–1 500 PLN |
| 生物安全柜（可选） | Esco Airstream、Telstar Bio II Advance | 15 000–40 000 PLN |
| 放大镜／菌落计数器 | Stuart SC6+、Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 显色大肠菌群琼脂（CCA） | — | 符合 ISO 9308-1 的显色培养基，含 Salmon-GAL + X-Glucuronide + Tergitol-7。厂商：Merck、Biokar、Oxoid |
| 0,45 µm 滤膜 | — | 混合纤维素酯（MCE），直径 47 mm，无菌、带网格。Merck Millipore、Sartorius、Pall |
| 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃） | 7772-98-7 | 用于中和样品中氯的片剂，每 500 mL 样品 18 mg/L |
| 林格液（1/4 浓度） | — | 用于稀释样品，无菌，9 mL 管装 |
| 缓冲蛋白胨水 | — | 稀释用替代液，0,1% 蛋白胨 + 0,85% NaCl，pH 7,0 |
| 氧化酶试剂（Kovacs） | 2436-85-3 | 氧化酶试纸，用于 E. coli 确认（氧化酶阴性）。四甲基对苯二胺 |
职业健康与安全
- 水样可能含病原体 —— 佩戴丁腈手套并穿实验服
- 培养后长有菌落的平板按感染性材料处理 —— 处置前须高压灭菌
- 使用本生灯 —— 有烫伤风险，不得无人看管
- 硫代硫酸钠 —— 风险低，避免接触眼睛
- 紫外灯 —— 不得直视光源，有眼损伤风险
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017 — 《Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora》。
该方法的原理是什么？
水样经 0,45 µm 滤膜（直径 47 mm）过滤以截留细菌，滤膜转移至显色 CCA 培养基表面。培养基含两种显色底物：Salmon-GAL 被 β-半乳糖苷酶（大肠菌群的酶）水解，生成鲑肉粉色产物；X-Glucuronide 被 β-葡萄糖醛酸酶（E.
测量范围和准确度是多少？
结果：cfu/100 mL（菌落形成单位）；限值（饮用水）：E. coli：0 cfu/100 mL；大肠菌群：0 cfu/100 mL；培养温度：36 ± 2 °C；培养时间：18–24 小时。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 19 小时 19 分钟–1 天 1 小时 19 分钟。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
膜过滤装置、真空泵、36 °C 细菌培养箱、灭菌用高压灭菌器、紫外灯／本生灯、生物安全柜（可选）、放大镜／菌落计数器。核心仪器的参考价格（膜过滤装置）：3 000–12 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
饮用水质量控制（波兰法律公报 2017 年 —— E. coli：0 cfu/100 mL）；供水管网监测 —— 用户端取样点；地下水与取水口检测；处理与消毒后水的控制；瓶装水与泉水检测；公共建筑（医院、学校）用水监测；食品工业生产用水；应急检测 —— 供水管网事故后。
需要采取哪些安全防护措施？
水样可能含病原体 —— 佩戴丁腈手套并穿实验服；培养后长有菌落的平板按感染性材料处理 —— 处置前须高压灭菌；使用本生灯 —— 有烫伤风险，不得无人看管；硫代硫酸钠 —— 风险低，避免接触眼睛；紫外灯 —— 不得直视光源，有眼损伤风险。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 9308-1。