🦠 水中的E. coli（大肠埃希氏菌）和大肠菌群——采用酶底物培养基的MPN法（Colilert-18 / Quanti-Tray）
三句话速览
向100 ml水中加入脱水的Colilert-18培养基（ONPG/MUG定义底物技术），倒入Quanti-Tray或Quanti-Tray/2000定量盘，封盘后在(36 ± 2) °C下培养18–22 h；呈黄色的孔为大肠菌群，既呈黄色又在365 nm紫外下发荧光的孔为E。该检测依据 PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)；MPN范围：Quanti-Tray：< 1至 > 200.5/100 ml；Quanti-Tray/2000：< 1至2419/100 ml。整个程序共 6 个步骤；主要用于：生活饮用水的监测（按2026年5月22日卫生部长条例，Dz.U. 2026 poz. 748［2026年《波兰法律公报》第748项］，附件4第A部分第1点为参比方法）和配水管网中水的监测——18 h后即出结果、悬浮物含量大、异养菌本底高而膜过滤失效的水（地表水、原水、水井）、海水和微咸水——按1→10稀释后测定E. coli（海水中的大肠菌群不在适用之列）。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 样品体积: 100 ml（或补足至100 ml的稀释液）；海水1→10
- 培养基: Colilert-18，每次试验2.8 g；在2–25 °C避阳光保存
- 培养: (36 ± 2) °C，18–22 h
概述
粪便污染的存在及其程度是评定水质和感染风险的重要因素；检验栖居于人和温血动物肠道中的Escherichia coli的存在即可指示这种污染。大肠菌群的结果较难解释，因为其中一部分生活在土壤和地表水中——它们的存在并不证明有粪便污染，但可能指示净水工艺失效或有水渗入管网。ISO 9308-2:2012（第二版，取代ISO 9308-2:1990）规定了水中E. coli和大肠菌群的定量测定方法，该方法基于在液体培养基中的生长并由表格计算最可能数（MPN）。它适用于所有种类的水，也包括悬浮物含量大、异养菌本底高的水；不得用它测定海水中的大肠菌群，而测定海水中的E. coli通常要求在无菌水中按1→10稀释。E. coli的检出基于β-D-葡糖醛酸酶的表达，因此该方法检不出许多通常不产生该酶的肠出血性菌株（如O157）——它们表现为大肠菌群。结果无需对阳性孔作进一步确证即为已确证的结果。ISO提请注意，采用该标准可能涉及IDEXX的专利（Colilert-18、Quanti-Tray）。在波兰，现行的2026年5月22日卫生部长关于生活饮用水水质的条例（Dz.U. 2026 poz. 748［2026年《波兰法律公报》第748项］）附件4第A部分第1点为E. coli和大肠菌群指明的参比方法是：PN-EN ISO 9308-1标准或PN-EN ISO 9308-2标准——两者等同。2026年6月24日被废止的2017年12月7日条例（Dz.U. 2017 poz. 2294［2017年《波兰法律公报》第2294项］）也作了同样规定，因此法规的更替并不改变标准的选用。
方法原理
向水样（100 ml）或补足至100 ml的稀释液中加入一次性包装（snap pack）的脱水Colilert-18培养基（2.8 g），混匀至溶解，无菌地倒入Quanti-Tray定量盘（至多201个微生物/100 ml，51个孔）或Quanti-Tray/2000（至多2419个微生物/100 ml，97个孔）；用Quanti-Tray封口机封盘，在(36 ± 2) °C下培养18–22 h。黄色程度等于或深于比色对照器的孔判为大肠菌群阳性；呈黄色并在紫外（365 nm）下呈现任何程度荧光的孔判为E. coli阳性。黄色来自β-D-半乳糖苷酶对邻硝基苯基半乳糖苷（ONPG）的分解，荧光则来自β-D-葡糖醛酸酶把4-甲基伞形酮基葡糖醛酸苷（MUG）分解为发荧光的甲基伞形酮。大肠菌群是指产生β-D-半乳糖苷酶的Enterobacteriaceae（肠杆菌科）成员，E. coli则是同时产生这两种酶的成员。每100 ml的MPN由统计表或软件查得；对51孔的定量盘，MPN = N·ln[N/(N − X)]。该培养基也可用于经典的MPN试管布局（如1 × 50 ml和5 × 10 ml），或作为100 ml的存在／不存在试验——此时试管先在(36 ± 2) °C下预热20 min。稀释只能使用无菌、无抑制性、不含氧化剂的水（去离子水或自来水）；缓冲型、盐水型和蛋白胨型稀释液会干扰该试验。
应用领域
- 生活饮用水的监测（按2026年5月22日卫生部长条例，Dz.U. 2026 poz. 748［2026年《波兰法律公报》第748项］，附件4第A部分第1点为参比方法）和配水管网中水的监测——18 h后即出结果
- 悬浮物含量大、异养菌本底高而膜过滤失效的水（地表水、原水、水井）
- 海水和微咸水——按1→10稀释后测定E. coli（海水中的大肠菌群不在适用之列）
- 100 ml的存在／不存在试验以及采用同一培养基的经典MPN试管布局
- 卫生防疫站和自来水公司的实验室——无需确证，也无需计数菌落
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 样品体积 | 100 ml（或补足至100 ml的稀释液）；海水1→10 |
| 培养基 | Colilert-18，每次试验2.8 g；在2–25 °C避阳光保存 |
| 培养 | (36 ± 2) °C，18–22 h |
| 读数 | 黄色 ≥ 比色对照器 = 大肠菌群；黄色 + 365 nm紫外荧光 = E. coli |
| MPN范围 | Quanti-Tray：< 1至 > 200.5/100 ml；Quanti-Tray/2000：< 1至2419/100 ml |
| 运输与保存 | 按ISO 19458于(5 ± 3) °C；在采样当天或18 h内分析，特殊情况下至多24 h |
| 孔的容积 | Quanti-Tray约1.96 ml；Quanti-Tray/2000：小孔0.186 ml，大孔约1.86 ml |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)
- 标准名称（波兰语）
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby
- 标准名称（英语）
- Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 2: Most probable number method
分步操作程序
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采样与运输
按ISO 19458采样，于(5 ± 3) °C运输和保存；在采样当天或18 h内开始分析（特殊情况下至多24 h）。
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加入培养基
向100 ml样品（或稀释液；海水通常在无菌水中按1→10稀释）中无菌地加入一包Colilert-18（2.8 g），轻轻振摇至完全溶解。
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倒盘与封口
把加有培养基的样品倒入Quanti-Tray或Quanti-Tray/2000定量盘并用封口机封合；也可按MPN布局倒入无菌试管（如1 × 50 ml和5 × 10 ml），或把整个100 ml作存在／不存在试验培养——此时先在(36 ± 2) °C下预热20 min。
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培养
把定量盘在(36 ± 2) °C下培养18–22 h。
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读数
黄色程度至少与比色对照器相同的孔判为大肠菌群阳性；在暗室中于365 nm紫外灯下观察定量盘——呈现任何程度荧光的黄色孔为E. coli阳性。18 h后颜色可疑时，把培养延长至22 h；18 h之前出现的阳性结果和22 h后的阴性结果均有效。
-
计算与报告
由阳性孔数从表B.1/B.2或软件查得大肠菌群和E. coli的MPN/100 ml；没有阳性孔时结果为“< 1”（按1→10稀释时为“< 10”）。报告中给出方法、样品标识、结果和偏离；使用阳性对照、阴性对照和空白对照。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱(36 ± 2) °C | 恒温控制 | — |
| Quanti-Tray封口机 | 封合定量盘并自动把液体分配到各孔 | — |
| Quanti-Tray定量盘（51孔）或Quanti-Tray/2000（97孔） | 按预期数量选用（< 200或至2419/100 ml） | — |
| Quanti-Tray比色对照器和365 nm紫外灯 | 在暗室或暗箱中读数 | — |
| 开口宽、容量 ≥ 110 ml的无菌容器 | 带消泡剂B的瓶（可选） | — |
| 用于灭菌的高压灭菌器和干燥箱 | 按ISO 8199灭菌 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| Colilert-18（一次性包装的脱水培养基，2.8 g） | — | 含定义底物ONPG和MUG的培养基 |
| 无菌去离子水或不含氧化剂的自来水 | — | 稀释液（不含缓冲剂、盐和蛋白胨） |
| 消泡剂B（10 %硅酮悬浮液） | — | 可选——减少孔中的气泡 |
职业健康与安全
- 所处理的材料可能含有肠道病原菌——遵守良好微生物学操作规范，对用过的定量盘消毒并高压灭菌
- 365 nm紫外灯——读数时保护眼睛和皮肤
- 封口机会发热——不要触碰加热元件
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012) — 《Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 2: Most probable number method》。
该方法的原理是什么？
向水样（100 ml）或补足至100 ml的稀释液中加入一次性包装（snap pack）的脱水Colilert-18培养基（2.8 g），混匀至溶解，无菌地倒入Quanti-Tray定量盘（至多201个微生物/100 ml，51个孔）或Quanti-Tray/2000（至多2419个微生物/100 ml，97个孔）；用Quanti-Tray封口机封盘，在(36 ± 2) °C下培养18–22 h。
测量范围和准确度是多少？
样品体积：100 ml（或补足至100 ml的稀释液）；海水1→10；培养基：Colilert-18，每次试验2.8 g；在2–25 °C避阳光保存；培养：(36 ± 2) °C，18–22 h；读数：黄色 ≥ 比色对照器 = 大肠菌群；黄色 + 365 nm紫外荧光 = E. coli。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱(36 ± 2) °C、Quanti-Tray封口机、Quanti-Tray定量盘（51孔）或Quanti-Tray/2000（97孔）、Quanti-Tray比色对照器和365 nm紫外灯、开口宽、容量 ≥ 110 ml的无菌容器、用于灭菌的高压灭菌器和干燥箱。
该检测用于哪些场景？
生活饮用水的监测（按2026年5月22日卫生部长条例，Dz.U. 2026 poz. 748［2026年《波兰法律公报》第748项］，附件4第A部分第1点为参比方法）和配水管网中水的监测——18 h后即出结果；悬浮物含量大、异养菌本底高而膜过滤失效的水（地表水、原水、水井）；海水和微咸水——按1→10稀释后测定E. coli（海水中的大肠菌群不在适用之列）；100 ml的存在／不存在试验以及采用同一培养基的经典MPN试管布局；卫生防疫站和自来水公司的实验室——无需确证，也无需计数菌落。
需要采取哪些安全防护措施？
所处理的材料可能含有肠道病原菌——遵守良好微生物学操作规范，对用过的定量盘消毒并高压灭菌；365 nm紫外灯——读数时保护眼睛和皮肤；封口机会发热——不要触碰加热元件。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 9308-2。