🍄 食品中酵母和霉菌
采用表面涂布法在 DRBC 琼脂（aw > 0,95 的产品）或 DG18 琼脂（aw ≤ 0,95 的产品）上于 25°C 培养 5–7 天计数食品中的酵母和霉菌。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 9
- 各步骤合计时间: 5 天 1 小时 50 分钟
- 培养温度: 25 ± 1°C
- 培养时间: 5 天（必要时延长至 7 天）
- 培养基（aw > 0,95）: DRBC 琼脂（二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素）
概述
酵母和霉菌是无处不在的微生物，是食品腐败变质的主要原因——它们会导致食品的滋味、气味、质地和外观发生改变。某些霉菌（曲霉属、青霉属、镰刀菌属）产生真菌毒素——具有致癌、肝毒性、肾毒性和免疫抑制作用的次生代谢产物（黄曲霉毒素、赭曲霉毒素 A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮）。
PN-EN ISO 21527 标准分为两部分，按被检产品的水分活度（aw）区分。第 1 部分适用于 aw > 0,95 的产品（乳、肉、蛋、蔬菜、水果、鲜面食），采用 DRBC（Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar，二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素琼脂）培养基。第 2 部分适用于 aw ≤ 0,95 的产品（干果、糕点、果酱、干肉、腌鱼、谷物、面粉、坚果、香辛料），采用 DG18（Dichloran 18% Glycerol Agar，二氯硝基苯胺 18% 甘油琼脂）培养基。
两种情况下均在 25 ± 1°C 培养 5 天（必要时可延长至 7 天）。二氯硝基苯胺和孟加拉红限制快速生长霉菌的蔓延并缩小菌落尺寸，便于计数。氯霉素抑制细菌生长。DG18 中的甘油降低培养基 aw，有利于耐旱性和嗜高渗真菌生长。
该方法广泛用于食品质量控制、生产车间环境监测和货架期评估。它不包括霉菌孢子计数和真菌种属鉴定——这些需要真菌学方法。
方法原理
将样品表面涂布于 DRBC（aw > 0,95）或 DG18（aw ≤ 0,95）培养基上。二氯硝基苯胺（2,6-二氯-4-硝基苯胺）限制快速生长霉菌（如根霉属、毛霉属）的蔓延。孟加拉红进一步缩小菌落尺寸，便于计数。氯霉素抑制细菌生长。DG18 中的甘油（18%）将培养基水分活度降至约 0,955，有利于嗜高渗酵母和耐旱霉菌生长。在 25°C 培养 5 天后，分别计数酵母菌落（光滑、湿润、凸起）和霉菌菌落（绒毛状、丝状、有色）。
应用领域
- 水果、蔬菜和果汁质量控制
- 谷物制品检验 — 面粉、麦片、谷物片、面包
- 干制品监测 — 坚果、香辛料、干果、草本茶
- 乳制品质量控制 — 酸奶、奶酪、冰淇淋
- 果酱、蜜饯、糖浆和蜂蜜检验
- 生产车间环境监测（涂抹样、沉降法）
- 食品微生物学货架期评估
- 化妆品和膳食补充剂控制
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养温度 | 25 ± 1°C |
| 培养时间 | 5 天（必要时延长至 7 天） |
| 培养基（aw > 0,95） | DRBC 琼脂（二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素） |
| 培养基（aw ≤ 0,95） | DG18 琼脂（二氯硝基苯胺 18% 甘油琼脂） |
| 接种方式 | 表面涂布，每皿 0,1 mL |
| 计数范围 | 每皿 10–150 个菌落（典型和非典型） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej powyżej 0,95 / Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej ≤ 0,95
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95 / Part 2: Colony count technique in products with water activity ≤ 0.95
分步操作程序
-
测定产品水分活度
用水分活度仪测量样品 aw。若 aw > 0,95 → 使用 DRBC。若 aw ≤ 0,95 → 使用 DG18。
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样品制备
称取 10 g 样品于均质袋中，加入 90 mL 缓冲蛋白胨水，均质 60–120 s。制备十倍稀释系列。
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培养基制备
将相应量的培养基（DRBC 或 DG18）溶于蒸馏水。高压灭菌（121°C/15 min）。冷却至 47°C。加入氯霉素。倾注平板（18–20 mL）。烘干表面。
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表面涂布
取 0,1 mL 稀释液加于平板表面。用涂布棒涂布。做平行样。静置至接种物被吸收。
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培养
平板正放（皿底朝下）于 25 ± 1°C 培养。切勿倒置 — 否则霉菌会在皿盖上蔓延。
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2–3 天检查
2–3 天后检查生长情况。标记可能影响 5 天后计数的快速生长霉菌。
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5 天终读
分别计数酵母菌落（光滑、湿润、乳脂状）和霉菌菌落（绒毛状、丝状、有色）。选取 10–150 个菌落的平板计数。若 5 天后生长微弱，可延长培养至 7 天。
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计算
分别（或合并）以平行样的加权平均计算酵母和霉菌数。结果以 CFU/g 表示。
-
质量控制
阳性对照：酿酒酵母（酵母）和黑曲霉 ATCC 16404（霉菌）。培养基无菌性对照。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 25°C 实验室培养箱 | Binder BD 56、Memmert IPP 110、POL-EKO ST 2 | 5 000–18 000 PLN |
| II 级生物安全柜 | Thermo Scientific MSC-Advantage、ESCO Airstream AC2 | 25 000–60 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| 44–47°C 水浴 | Memmert WNB 14、Julabo TW 12 | 3 000–10 000 PLN |
| 水分活度仪（aw） | Novasina LabMaster-aw、Rotronic HygroLab C1 | 8 000–25 000 PLN |
| 实验室高压灭菌器 | Tuttnauer 2540M、Systec VX-65 | 15 000–45 000 PLN |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 300、Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| DRBC 琼脂（二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素） | 99-30-9 | 适用于 aw > 0,95 的产品；蛋白胨、葡萄糖、二氯硝基苯胺、孟加拉红、氯霉素、琼脂；500 g 装 |
| DG18 琼脂（二氯硝基苯胺 18% 甘油琼脂） | 56-81-5 | 适用于 aw ≤ 0,95 的产品；蛋白胨、葡萄糖、二氯硝基苯胺、甘油 220 g/L、氯霉素、琼脂；500 g 装 |
| 二氯硝基苯胺（2,6-二氯-4-硝基苯胺） | 99-30-9 | 限制快速生长霉菌的蔓延，浓度 2 mg/L |
| 孟加拉红 | 632-69-9 | 限制霉菌菌落尺寸的染料，浓度 25 mg/L |
| 氯霉素 | 56-75-7 | 抑制细菌生长的抗生素；乙醇中 1% 溶液，终浓度 100 mg/L |
| 甘油 | 56-81-5 | DG18 组分，将培养基水分活度降至约 0,955；220 g/L |
| 缓冲蛋白胨水（BPW） | — | 用于样品稀释，500 g 装 |
职业健康与安全
- 某些霉菌产生真菌毒素和过敏原 — 在生物安全柜中操作
- 霉菌孢子极易扬散 — 打开平板时避免快速动作
- 氯霉素 — 可能有害，避免皮肤接触和吸入
- 二氯硝基苯胺 — 有刺激性，佩戴手套和实验服
- 带霉菌的平板须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95 / Part 2: Colony count technique in products with water activity ≤ 0.95》。
该方法的原理是什么？
将样品表面涂布于 DRBC（aw > 0,95）或 DG18（aw ≤ 0,95）培养基上。二氯硝基苯胺（2,6-二氯-4-硝基苯胺）限制快速生长霉菌（如根霉属、毛霉属）的蔓延。
测量范围和准确度是多少？
培养温度：25 ± 1°C；培养时间：5 天（必要时延长至 7 天）；培养基（aw > 0,95）：DRBC 琼脂（二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素）；培养基（aw ≤ 0,95）：DG18 琼脂（二氯硝基苯胺 18% 甘油琼脂）。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 5 天 1 小时 50 分钟。整个程序共 9 个步骤。
需要哪些设备？
25°C 实验室培养箱、II 级生物安全柜、拍击式均质器、44–47°C 水浴、水分活度仪（aw）、实验室高压灭菌器、菌落计数器。核心仪器的参考价格（25°C 实验室培养箱）：5 000–18 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
水果、蔬菜和果汁质量控制；谷物制品检验 — 面粉、麦片、谷物片、面包；干制品监测 — 坚果、香辛料、干果、草本茶；乳制品质量控制 — 酸奶、奶酪、冰淇淋；果酱、蜜饯、糖浆和蜂蜜检验；生产车间环境监测（涂抹样、沉降法）；食品微生物学货架期评估；化妆品和膳食补充剂控制。
需要采取哪些安全防护措施？
某些霉菌产生真菌毒素和过敏原 — 在生物安全柜中操作；霉菌孢子极易扬散 — 打开平板时避免快速动作；氯霉素 — 可能有害，避免皮肤接触和吸入；二氯硝基苯胺 — 有刺激性，佩戴手套和实验服；带霉菌的平板须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 21527。