🦠 水分活度aw > 0.95产品中的酵母菌和霉菌——DRBC琼脂表面涂布，25 °C，5天
三句话速览
把样品或在0.1 %蛋白胨水中的稀释液表面涂布于DRBC琼脂（二氯硝基苯胺孟加拉红氯霉素），在(25 ± 1) °C下需氧培养5天（必要时在散射日光下放置1–2天），计数酵母菌和霉菌的菌落，并在双目放大镜或显微镜下把它们与细菌区分开。该检测依据 PN-ISO 21527-1:2009；范围：aw > 0.95的产品。整个程序共 6 个步骤；主要用于：水分活度高的产品：肉和腌制肉制品、蛋和蛋制品、酸奶、干酪、稀奶油、果汁和水果、蔬菜、色拉、新鲜酱料、冷藏食品的货架期和生产卫生评价；投诉检验（酵母菌引起的腐败）、湿性饲料和原料。
要点速览
- 标准: PN-ISO 21527-1:2009
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 范围: aw > 0.95的产品
- 培养: (25 ± 1) °C，5天，需氧；可选在散射日光下1–2天
- 培养基: DRBC：葡萄糖10 g、二氯硝基苯胺2 mg、孟加拉红25 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每块平板15 ml；避光
概述
标准状态：PN-ISO 21527-1:2009（采用ISO 21527-1:2008）已于2020年9月25日被PKN（波兰标准化委员会）撤销，未指明后继标准；ISO 21527-1:2008本身仍然有效。
ISO 21527-1:2008规定了用(25 ± 1) °C下的菌落计数法测定供人食用和动物饲用的、水分活度高于0.95的产品——蛋、肉、乳制品（乳粉除外）、水果、蔬菜、新鲜酱料等——中活酵母菌和霉菌数量的水平法。它不能测定霉菌的孢子；真菌的鉴定和霉菌毒素的检验不在其范围内；该方法不适用于果蔬罐头中的耐热真菌（Byssochlamys fulva、B. nivea）。酵母菌定义为在25 °C下于真菌学培养基上形成无光泽或有光泽、边缘规则、表面凸起的圆形菌落的嗜温需氧微生物，霉菌则定义为形成扁平或绒毛状、蔓延的菌落、常带有彩色产孢结构的嗜温需氧丝状生物；两者的区分有时是约定性的。标准提示，计数霉菌须格外小心，以保护操作者并防止孢子污染空气。在波兰它以PN-ISO 21527-1:2009引入（取代了PN-ISO 7954:1999）；PKN已于2020年9月25日撤销该标准，但ISO 21527-1:2008仍然有效，食品实验室普遍“按PN-ISO 21527-1:2009”测定酵母菌和霉菌数。第2部分（ISO 21527-2）涉及aw ≤ 0.95的产品和DG18培养基。
方法原理
把规定量的液体样品、初始悬液或十倍稀释液表面涂布于选择性培养基上制备平板；平板在(25 ± 1) °C下需氧培养5天，必要时在散射日光下放置1–2天；计数菌落／繁殖体，可疑菌落（酵母菌与细菌）在双目放大镜（6.5–50×）或显微镜（250–1000×）下检查；每g或每ml的酵母菌和霉菌数由菌落数可计数的平板计算，必要时把霉菌和酵母菌分别计数。稀释液：推荐0.1 %蛋白胨水（水解物1 g/l，pH 7.0 ± 0.2）；可向稀释液中加入0.05 % Tween 80以减少孢子结块。DRBC培养基（每1000 ml）：动物和植物组织水解物5 g、D-葡萄糖10 g、KH₂PO₄ 1 g、MgSO₄·H₂O 0.5 g、二氯硝基苯胺（2,6-二氯-4-硝基苯胺）0.002 g、孟加拉红0.025 g、琼脂12–15 g、氯霉素0.1 g；不含氯霉素的各组分先煮沸，灭菌后pH 5.6 ± 0.2，加入10 ml 1 %氯霉素乙醇溶液，121 °C灭菌15 min，在44–47 °C下冷却并按每块平板15 ml分装；培养基须避光（孟加拉红的细胞毒性分解产物会使结果偏低）。选项：细菌过度生长时（如生肉）用金霉素50 mg/l + 氯霉素50 mg/l（不推荐庆大霉素）、用微量元素（ZnSO₄、CuSO₄）以获得霉菌的完整形态、用Tergitol 1 ml/l抑制Mucoraceae（毛霉科）的过度生长。培养基性能试验：产率——在25 °C下5天，用Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763、Candida albicans ATCC 10231、Aspergillus niger ATCC 16404、Mucor racemosus ATCC 42647相对SDA（PR ≥ 0.5）；选择性——完全抑制E. coli ATCC 25922或Bacillus subtilis ATCC 6633。
应用领域
- 水分活度高的产品：肉和腌制肉制品、蛋和蛋制品、酸奶、干酪、稀奶油、果汁和水果、蔬菜、色拉、新鲜酱料
- 冷藏食品的货架期和生产卫生评价；投诉检验（酵母菌引起的腐败）
- 湿性饲料和原料
- 真菌学培养基的质量控制（按ISO/TS 11133作性能试验）
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 范围 | aw > 0.95的产品 |
| 培养 | (25 ± 1) °C，5天，需氧；可选在散射日光下1–2天 |
| 培养基 | DRBC：葡萄糖10 g、二氯硝基苯胺2 mg、孟加拉红25 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每块平板15 ml；避光 |
| 接种 | 表面涂布；涂布棒直径 < 2 mm、长80 mm |
| 稀释液 | 0.1 %蛋白胨水（pH 7.0 ± 0.2），可选0.05 % Tween 80 |
| 可选添加物 | 金霉素50 mg/l（+ 氯霉素50 mg/l）；微量元素1 ml/l；Tergitol 1 ml/l |
| 培养基的控制 | S. cerevisiae ATCC 9763、C. albicans ATCC 10231、A. niger ATCC 16404、M. racemosus ATCC 42647——相对SDA PR ≥ 0.5；E. coli／B. subtilis——完全抑制 |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 21527-1:2009
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody wyższej niż 0,95
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95
分步操作程序
-
培养基的制备
把不含氯霉素的DRBC各组分混悬、煮沸，把pH调到灭菌后为5.6 ± 0.2，加入10 ml 1 %氯霉素乙醇溶液，121 °C灭菌15 min，在44–47 °C下冷却并按每块15 ml分装；按ISO 7218干燥平板表面并避光保存。
-
样品与稀释液
按ISO 6887／ISO 8261制备初始悬液和十倍稀释液，推荐的稀释液为0.1 %蛋白胨水（可选0.05 % Tween 80）。
-
表面涂布
把规定量的液体样品、初始悬液或稀释液滴加到DRBC平板表面，并用涂布棒（直径 < 2 mm，以尽量减少留在涂布棒上的样品量）涂开。
-
培养
在(25 ± 1) °C下需氧培养5天；必要时把平板在散射日光下放置1–2天。
-
计数
在菌落数可计数的平板上计数菌落／繁殖体；可疑菌落（酵母菌与细菌）在双目放大镜或显微镜下检查；必要时把霉菌和酵母菌分别计数。
-
结果
由所选稀释度的平板计算每g或每ml的酵母菌和霉菌数；注明培养基中使用的可选添加物和偏离情况。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱(25 ± 1) °C | — | |
| 水浴44–47 °C | 冷却培养基 | — |
| 无菌1 ml（0.1 ml）移液管、90–100 mm培养皿、玻璃或塑料涂布棒（< 2 mm，80 mm） | — | |
| 双目放大镜（6.5–50×）和显微镜（250–1000×） | 把酵母菌与细菌、霉菌与酵母菌区分开 | — |
| pH计（25 °C下 ± 0.1 pH）、瓶、烧瓶、试管 | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| DRBC琼脂（二氯硝基苯胺、孟加拉红、氯霉素） | — | 限制霉菌蔓延并抑制细菌的选择性真菌学培养基 |
| 氯霉素——1 %乙醇溶液（10 ml/l） | — | 抑制细菌 |
| 0.1 %蛋白胨水 | — | 稀释液 |
| 可选：金霉素盐酸盐0.1 %（新鲜配制，过滤）、ZnSO₄·7H₂O 1 g + CuSO₄·5H₂O 0.5 g/100 ml溶液、Tergitol、Tween 80 | — | 按标准5.2.1.2.2–5.2.1.2.4的添加物 |
| 对照菌株（ATCC 9763、10231、16404、42647、25922、6633） | — | 培养基性能试验 |
职业健康与安全
- 霉菌孢子——操作须极其小心，最好在安全柜中进行，以保护操作者并避免污染实验室空气
- 氯霉素和金霉素——抗生素；避免扬尘和接触皮肤；二氯硝基苯胺和孟加拉红——称量时戴手套
- 培养基对光敏感——其分解产物具有细胞毒性
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 21527-1:2009 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95》。
该方法的原理是什么？
把规定量的液体样品、初始悬液或十倍稀释液表面涂布于选择性培养基上制备平板；平板在(25 ± 1) °C下需氧培养5天，必要时在散射日光下放置1–2天；计数菌落／繁殖体，可疑菌落（酵母菌与细菌）在双目放大镜（6.5–50×）或显微镜（250–1000×）下检查；每g或每ml的酵母菌和霉菌数由菌落数可计数的平板计算，必要时把霉菌和酵母菌分别计数。
测量范围和准确度是多少？
范围：aw > 0.95的产品；培养：(25 ± 1) °C，5天，需氧；可选在散射日光下1–2天；培养基：DRBC：葡萄糖10 g、二氯硝基苯胺2 mg、孟加拉红25 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每块平板15 ml；避光；接种：表面涂布；涂布棒直径 < 2 mm、长80 mm。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱(25 ± 1) °C、水浴44–47 °C、无菌1 ml（0.1 ml）移液管、90–100 mm培养皿、玻璃或塑料涂布棒（< 2 mm，80 mm）、双目放大镜（6.5–50×）和显微镜（250–1000×）、pH计（25 °C下 ± 0.1 pH）、瓶、烧瓶、试管。
该检测用于哪些场景？
水分活度高的产品：肉和腌制肉制品、蛋和蛋制品、酸奶、干酪、稀奶油、果汁和水果、蔬菜、色拉、新鲜酱料；冷藏食品的货架期和生产卫生评价；投诉检验（酵母菌引起的腐败）；湿性饲料和原料；真菌学培养基的质量控制（按ISO/TS 11133作性能试验）。
需要采取哪些安全防护措施？
霉菌孢子——操作须极其小心，最好在安全柜中进行，以保护操作者并避免污染实验室空气；氯霉素和金霉素——抗生素；避免扬尘和接触皮肤；二氯硝基苯胺和孟加拉红——称量时戴手套；培养基对光敏感——其分解产物具有细胞毒性。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 21527-1。