🦠 aw ≤ 0.95的产品中的嗜渗酵母菌和耐旱霉菌——DG18琼脂表面涂布法，25 °C，5–7天
三句话速览
把样品或稀释液（建议使用含20–35 %甘油或葡萄糖的稀释液，以避免渗透压休克）表面涂布接种于含二氯硝基苯胺和18 %甘油的琼脂（DG18，aw 0。该检测依据 PN-ISO 21527-2:2009；适用范围：aw ≤ 0.95的产品；不适用于嗜盐真菌（干鱼）。整个程序共 6 个步骤；主要用于：干制品和水分活度降低的产品：干果、坚果、谷物和面粉、香辛料、糕点、果酱、干肉和成熟肉制品、奶粉、干饲料和饲料原料、库存原料中耐旱霉菌（Eurotium、Aspergillus restrictus、Wallemia）风险的评估。
要点速览
- 标准: PN-ISO 21527-2:2009
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 6
- 适用范围: aw ≤ 0.95的产品；不适用于嗜盐真菌（干鱼）
- 培养: (25 ± 1) °C，5–7天，需氧；可选在散射光下1–2天
- 培养基: DG18：甘油220 g/l（aw ≈ 0.95）、二氯硝基苯胺2 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每皿15 ml；须避光
概述
标准状态：PN-ISO 21527-2:2009（采用ISO 21527-2:2008）已由PKN（波兰标准化委员会）于2020年9月25日撤销，未指明替代标准；ISO 21527-2:2008本身仍然有效。
ISO 21527-2:2008规定了测定水分活度低于或等于0.95的供人食用和动物饲用产品（如干果、糕点、果酱、干肉、面粉和谷物、香辛料、坚果、干饲料）中活的嗜渗酵母菌和耐旱霉菌数量的水平法；它不能用于测定霉菌孢子，真菌的鉴定和霉菌毒素的检验也在适用范围之外。该方法不适用于例如存在于干鱼中的嗜盐耐旱真菌（Polypaecilum pisce、Basipetospora halophila）。嗜渗酵母菌和耐旱霉菌定义为能在aw ≤ 0.95条件下生长的真菌；其余定义采自ISO 21527-1。实验室样品不得冷冻。在波兰该标准以PN-ISO 21527-2:2009施行；PKN已于2020年9月25日将其撤销，但ISO 21527-2:2008仍然有效，实验室仍“按PN-ISO 21527-2:2009”测定干制品中的酵母菌和霉菌数。第1部分涉及aw > 0.95的产品和DRBC培养基。
方法原理
在选择性培养基上制备用规定量的样品、初始悬液或稀释液表面涂布的平板，在(25 ± 1) °C下需氧培养5–7天（必要时在散射日光下1–2天）；计数菌落，可疑者用双目放大镜或显微镜检查，并由菌落数可计的平板计算每g或每ml的数量，必要时分别计数酵母菌和霉菌。配制稀释液时建议使用含足量溶质的稀释液——20–35 %甘油或D-葡萄糖溶液——以尽量减小细胞的渗透压休克；此外可用0.1 %蛋白胨水（pH 7.0 ± 0.2），并可选择加入0.05 % Tween 80。由于孢子沉降很快，移液管应保持水平，悬液应加以振摇；均质宜优先使用拍击式均质器。DG18培养基（每1000 ml）：酪蛋白水解物5 g、D-葡萄糖10 g、KH₂PO₄ 1 g、MgSO₄·H₂O 0.5 g、二氯硝基苯胺0.002 g、无水甘油220 g、琼脂12–15 g、氯霉素0.1 g；不含氯霉素的各组分先煮沸，灭菌后pH为5.6 ± 0.2，加入10 ml 1 %氯霉素乙醇溶液，121 °C灭菌15 min，冷却至44–47 °C并按每皿15 ml分装；须避光。可选项：金霉素50 mg/l + 氯霉素50 mg/l（不推荐庆大霉素）、微量元素（ZnSO₄·7H₂O 1 g、CuSO₄·5H₂O 0.5 g/100 ml；1 ml/l）。性能试验：产率——在25 °C下5天，用Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763、Wallemia sebi ATCC 42694、Aspergillus restrictus ATCC 42693、Eurotium rubrum ATCC 42690相对SDA测定（PR ≥ 0.5）；选择性——完全抑制E. coli ATCC 25922和Bacillus subtilis ATCC 6633。
应用领域
- 干制品和水分活度降低的产品：干果、坚果、谷物和面粉、香辛料、糕点、果酱、干肉和成熟肉制品、奶粉
- 干饲料和饲料原料
- 库存原料中耐旱霉菌（Eurotium、Aspergillus restrictus、Wallemia）风险的评估
- 低aw真菌培养基的质量控制
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 适用范围 | aw ≤ 0.95的产品；不适用于嗜盐真菌（干鱼） |
| 培养 | (25 ± 1) °C，5–7天，需氧；可选在散射光下1–2天 |
| 培养基 | DG18：甘油220 g/l（aw ≈ 0.95）、二氯硝基苯胺2 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每皿15 ml；须避光 |
| 稀释液 | 20–35 %甘油或D-葡萄糖（渗透压休克）或0.1 %蛋白胨水；可选0.05 % Tween 80 |
| 技术 | 表面涂布接种；移液管保持水平（孢子沉降）；拍击式均质器 |
| 培养基的控制 | S. cerevisiae ATCC 9763、W. sebi ATCC 42694、A. restrictus ATCC 42693、E. rubrum ATCC 42690——PR ≥ 0.5；E. coli和B. subtilis——完全抑制 |
| 样品 | 实验室样品不得冷冻 |
标准
- 标准编号
- PN-ISO 21527-2:2009
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wody niższej lub równej 0,95
- 标准名称（英语）
- Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95
分步操作程序
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培养基
把不含氯霉素的DG18各组分悬浮、煮沸，调节pH（灭菌后为5.6 ± 0.2），加入10 ml 1 %氯霉素乙醇溶液，121 °C灭菌15 min，冷却至44–47 °C，按每皿15 ml分装，干燥表面并避光保存。
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样品
不得冷冻实验室样品；按ISO 6887 / ISO 7218 / ISO 8261制备初始悬液和稀释液，最好使用含20–35 %甘油或葡萄糖的稀释液（或0.1 %蛋白胨水），用拍击式均质器均质。
-
表面涂布接种
振摇悬液，移液管保持水平；把规定量滴加到DG18平板表面，并用涂布棒涂开。
-
培养
在(25 ± 1) °C下需氧培养5–7天；必要时在散射日光下1–2天。
-
计数
在菌落数可计的平板上计数菌落，可疑者用双目放大镜或显微镜检查；必要时分别计数酵母菌和霉菌。
-
结果
计算每g或每ml的酵母菌和霉菌数，并说明所用的可选添加物以及偏离之处。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱(25 ± 1) °C | — | |
| 水浴44–47 °C | 冷却培养基 | — |
| 拍击式均质器 | 优先于搅拌器或振荡器 | — |
| 1 ml（0.1 ml）移液管、90–100 mm培养皿、涂布棒（< 2 mm，80 mm） | — | |
| 双目放大镜（6.5–50×）、显微镜（250–1000×）、pH计（± 0.1） | — |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| DG18琼脂（二氯硝基苯胺、18 %甘油、氯霉素） | — | 供耐旱和嗜渗真菌使用的aw ≈ 0.95选择性培养基 |
| 无水甘油（培养基中220 g/l；稀释液中20–35 %） | — | 降低水分活度 |
| 1 %氯霉素乙醇溶液（10 ml/l） | — | 抑制细菌 |
| 0.1 %蛋白胨水；可选0.1 %金霉素（新配、过滤）、微量元素、Tween 80 | — | 稀释液和可选添加物 |
| 对照菌株（ATCC 9763、42694、42693、42690、25922、6633） | — | 培养基的性能试验 |
职业健康与安全
- 耐旱霉菌的孢子易于扩散——操作须谨慎，在安全柜中进行；处理干燥、易扬尘的样品时须保护呼吸道
- 氯霉素、金霉素、二氯硝基苯胺——避免扬尘和接触皮肤
- 培养基对光敏感——须避光保存
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-ISO 21527-2:2009 — 《Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0,95》。
该方法的原理是什么？
在选择性培养基上制备用规定量的样品、初始悬液或稀释液表面涂布的平板，在(25 ± 1) °C下需氧培养5–7天（必要时在散射日光下1–2天）；计数菌落，可疑者用双目放大镜或显微镜检查，并由菌落数可计的平板计算每g或每ml的数量，必要时分别计数酵母菌和霉菌。配制稀释液时建议使用含足量溶质的稀释液——20–35 %甘油或D-葡萄糖溶液——以尽量减小细胞的渗透压休克；此外可用0.
测量范围和准确度是多少？
适用范围：aw ≤ 0.95的产品；不适用于嗜盐真菌（干鱼）；培养：(25 ± 1) °C，5–7天，需氧；可选在散射光下1–2天；培养基：DG18：甘油220 g/l（aw ≈ 0.95）、二氯硝基苯胺2 mg、氯霉素0.1 g/l；pH 5.6 ± 0.2；每皿15 ml；须避光；稀释液：20–35 %甘油或D-葡萄糖（渗透压休克）或0.1 %蛋白胨水；可选0.05 % Tween 80。
完成检测需要多长时间？
整个程序共 6 个步骤。标准未对每个步骤给出时长——实际用时取决于实验室自身的操作程序。
需要哪些设备？
培养箱(25 ± 1) °C、水浴44–47 °C、拍击式均质器、1 ml（0.1 ml）移液管、90–100 mm培养皿、涂布棒（< 2 mm，80 mm）、双目放大镜（6.5–50×）、显微镜（250–1000×）、pH计（± 0.1）。
该检测用于哪些场景？
干制品和水分活度降低的产品：干果、坚果、谷物和面粉、香辛料、糕点、果酱、干肉和成熟肉制品、奶粉；干饲料和饲料原料；库存原料中耐旱霉菌（Eurotium、Aspergillus restrictus、Wallemia）风险的评估；低aw真菌培养基的质量控制。
需要采取哪些安全防护措施？
耐旱霉菌的孢子易于扩散——操作须谨慎，在安全柜中进行；处理干燥、易扬尘的样品时须保护呼吸道；氯霉素、金霉素、二氯硝基苯胺——避免扬尘和接触皮肤；培养基对光敏感——须避光保存。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-ISO 21527-2。