🧫 30°C 菌落总数（TVC）
用倾注平板法计数食品中的需氧嗜温菌总数。总体卫生状况指标。
要点速览
- 标准: PN-EN ISO 4833-1:2013
- 类别: 微生物
- 操作步骤数: 10
- 各步骤合计时间: 3 天 1 小时
- 培养温度: 30 ± 1°C
- 培养时间: 72 ± 3 小时
- 计数范围: 每皿 10–300 个菌落
概述
30°C 菌落总数（TVC / 平板菌落总数）是食品微生物质量的基本指标之一。它并非针对特定病原菌的检验，而是对总体微生物污染 — 即产品"总体卫生状况" — 的测量。
菌落总数高表明：生产卫生不达标、冷链中断、储存时间过长、储存条件不当，或热处理不充分。
倾注平板法是将稀释后的样品与熔化的 PCA（平板计数琼脂）混合，在 30°C 培养 72 小时后计数长出的菌落。结果以 CFU/g（每克菌落形成单位）表示。
这是（EC）2073/2005 号法规对许多食品类别（乳制品、即食食品、冷冻食品、果汁）所要求的基准方法。
方法原理
倾注平板技术： 1. 将样品均质并在蛋白胨生理盐水稀释液中制备十倍稀释系列（10⁻¹、10⁻²、10⁻³……）。 2. 取每个稀释度 1 mL 移入无菌培养皿。 3. 倾入约 15 mL 熔化的 PCA（冷却至 44–47°C）。 4. 用旋转动作混匀（顺时针 8 次、逆时针 8 次）后静置凝固。 5. 将平板倒置，在 30±1°C 培养 72±3 小时。 6. 选取菌落数为 10–300 的平板计数。
结果 [CFU/g] = 平均菌落数 × 稀释倍数的倒数。
应用领域
- 即食食品质量控制
- 乳与乳制品检验（过程卫生标准）
- 肉类及肉制品控制
- 饮料、果汁和瓶装水检验
- 生产车间卫生监测（涂抹样）
- 来料质量控制 — 进货的微生物评价
关键参数
| 参数 | 数值 |
|---|---|
| 培养温度 | 30 ± 1°C |
| 培养时间 | 72 ± 3 小时 |
| 计数范围 | 每皿 10–300 个菌落 |
| 结果单位 | CFU/g 或 CFU/mL |
| 检出限 | <10 CFU/g（10⁻¹ 稀释度时） |
| 培养基 | PCA — 平板计数琼脂（胰蛋白胨-葡萄糖） |
标准
- 标准编号
- PN-EN ISO 4833-1:2013
- 标准名称（波兰语）
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 1: Oznaczanie liczby metodą płytkową w temperaturze 30°C
- 标准名称（英语）
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate technique
分步操作程序
-
配制 PCA 培养基
将 PCA 溶于蒸馏水。在 121°C 高压灭菌 15 min。在水浴中冷却至 44–47°C（琼脂须保持熔融但不烫）。
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样品制备
称取 10 g 样品于均质袋中。加入 90 mL 稀释液（1:10 = 10⁻¹ 稀释）。均质 1–2 min。
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系列稀释
取 1 mL 10⁻¹ 悬液转入 9 mL 稀释液 → 10⁻²。依次重复：10⁻³、10⁻⁴……每个稀释度更换新吸头。转移之间涡旋混匀。
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接种 — 移入培养皿
从选定稀释度各取 1 mL 移入无菌培养皿（每个稀释度 2 皿 = 平行样）。在酒精灯旁或生物安全柜内操作。
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倾注 PCA
向每皿倾入约 15 mL 熔化的 PCA（44–47°C）。用手背试温 — 温热而不烫。立即用旋转动作混匀：顺时针 8 次、逆时针 8 次、前后 8 次、左右 8 次。
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琼脂凝固
将平板置于水平面上静置至完全凝固（约 15 min）。此期间不得移动平板！
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培养
将平板倒置（皿盖朝下，以免冷凝水滴到菌落上）。在 30±1°C 培养 72±3 小时。
-
菌落计数
72 h 后，选取菌落数为 10–300 的平板计数。使用带放大镜的菌落计数器。计数所有菌落 — 大小、形态各异者均计。
-
计算
N = ΣC / [V ×（n₁ + 0,1×n₂）× d]，其中 ΣC = 菌落数之和，V = 接种体积（1 mL），n₁ = 低稀释度平板数，n₂ = 高稀释度平板数，d = 低稀释度。结果以 CFU/g 表示。
-
质量控制
对照平板（空白）：仅 PCA 琼脂 — 应无生长。每批检查稀释液和培养基的无菌性。
所需设备与仪器
| 设备 | 示例 | 参考价格 |
|---|---|---|
| 培养箱 30±1°C | Memmert IN110、Binder BD 115、POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| 拍击式均质器 | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| 高压灭菌器 | Tuttnauer 3870ELV | 30 000–80 000 PLN |
| 44–47°C 水浴 | GFL 1003、Memmert WNB 14 — 用于保持 PCA 为熔融状态 | 3 000–8 000 PLN |
| 1 mL 移液器 | Eppendorf Research Plus、Brand Transferpette S | 800–1 500 PLN |
| ø 90 mm 培养皿 | 无菌、一次性、聚苯乙烯 | 150–300 PLN / 500 只 |
| 菌落计数器 | Interscience Scan 500、Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
试剂、培养基与耗材
| 试剂 | CAS | 详情 |
|---|---|---|
| 平板计数琼脂（PCA） | — | 胰蛋白胨-葡萄糖琼脂：每升含胰蛋白胨 5 g + 酵母浸粉 2,5 g + 葡萄糖 1 g + 琼脂 15 g。Merck 1.05463、Oxoid CM0325。 |
| 稀释液 — 蛋白胨生理盐水 | — | 每升水含 NaCl 8,5 g + 蛋白胨 1 g。Merck 1.12535。用于十倍稀释。 |
| 9 mL 稀释液管 | — | 无菌、带螺旋盖，用于 10⁻¹ 至 10⁻⁶ 稀释 |
| 均质袋 | — | 无菌、带侧滤膜（BagFilter），400 mL |
职业健康与安全
- 食品样品可能含病原菌 — 须戴手套
- 高温琼脂（约 47°C）— 有烫伤风险
- 高压灭菌器 — 高压高温，必须经过培训
- 所有废物须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃
- 须在洁净条件下作业 — 生物安全柜或专用区域
培训与视频资料
常见问题
该检测依据哪项标准？
该检测依据的标准为 PN-EN ISO 4833-1:2013 — 《Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate technique》。
该方法的原理是什么？
倾注平板技术： 1. 将样品均质并在蛋白胨生理盐水稀释液中制备十倍稀释系列（10⁻¹、10⁻²、10⁻³……）。
测量范围和准确度是多少？
培养温度：30 ± 1°C；培养时间：72 ± 3 小时；计数范围：每皿 10–300 个菌落；结果单位：CFU/g 或 CFU/mL。
完成检测需要多长时间？
各步骤所列时间合计约为 3 天 1 小时。整个程序共 10 个步骤。
需要哪些设备？
培养箱 30±1°C、拍击式均质器、高压灭菌器、44–47°C 水浴、1 mL 移液器、ø 90 mm 培养皿、菌落计数器。核心仪器的参考价格（培养箱 30±1°C）：5 000–15 000 PLN。
该检测用于哪些场景？
即食食品质量控制；乳与乳制品检验（过程卫生标准）；肉类及肉制品控制；饮料、果汁和瓶装水检验；生产车间卫生监测（涂抹样）；来料质量控制 — 进货的微生物评价。
需要采取哪些安全防护措施？
食品样品可能含病原菌 — 须戴手套；高温琼脂（约 47°C）— 有烫伤风险；高压灭菌器 — 高压高温，必须经过培训；所有废物须先高压灭菌（121°C/20 min）再废弃；须在洁净条件下作业 — 生物安全柜或专用区域。
哪家实验室可以开展此项检测？
该检测由通过 ISO/IEC 17025 认可的实验室开展。在 LabCoda 上可按标准编号检索 PN-EN ISO 4833-1。